单细胞多组学

健康与疾病样本的多组分析。

为了分析上述工作流程产生的数据，使用mRNA表达、表面蛋白表达或两者对4份CLL样本和3份健康供者样本进行了t-SNE分析。基于AbSeq数据生成的t-SNE图表明，与单独使用RNA-Seq数据相比，不同样本之间的分离度更高。mRNA和AbSeq数据的结合大大提高了不同样本的分辨率。如t-SNE图所示，四份CLL样本单独形成了不同的集群，而健康样本则有较大程度的重叠，这表明CLL患者的临床病程可能是异质性的。这些结果也凸显了多组学在分析单细胞图谱方面的作用。

健康供者样本和CLL样本间差异表达标志物的分析。

为了了解健康供者样本和CLL样本之间不同聚类的标记物，使用单细胞mRNA和AbSeq数据进行了差异表达分析。该分析确定了与健康供者样本相比CLL样本减少的标记物（第1组）。所有CLL样本中差异化增加的基因或蛋白质均列于在第2组（所有CLL），而一些CLL样本中增加的基因或蛋白质列于第3组。CLL患者中异常表达的标记物CD5在CLL03和CLL04中的表达水平高于其他样本。此外，还发现了一个与CLL04特异性相关的标记物子集（第4组），如CD11c。有趣的是，并非所有细胞都能分泌相同水平的CD11c，这就表明了CLL的肿瘤内异质性。

T细胞分析

对每个样品，可以分辨出不同的细胞簇，并且对于仅基于蛋白质的细胞簇，仅基于mRNA的细胞簇，或结合这两者的细胞簇，其分辨率是相当的。短时刺激的细胞簇（第14天）与新鲜T细胞和慢性刺激的细胞会分别出现，这说明与先前的观察相比存在明显的特征这说明与先前的观察相比存在明显的特征，表明它们在表型和功能上与新鲜细胞相似。慢性刺激细胞（第3天、第7天和第14天）形成的簇与新鲜细胞簇相互分开。这三个样品形成了不同的簇，这说明它们各自具有独特的特征。

BD^®AbSeq标记物数据与流式细胞术的一致性

流式细胞术和AbSeq检测的CD8T细胞表达标记百分比和细胞表面标记水平均表明，蛋白质表达的动力性能是一致的。这些数据有力地证明了这两种技术在研究蛋白质表达方面的一致性和实用性。

通过单核细胞分析对调节性T细胞分化进行表型特征研究  

采用无监督的高维数据分析，改进对调节性T细胞亚群的识别。采用Monocle算法进行单细胞轨迹分析，并确定细胞分化过程的过渡状态。根据22个蛋白和399个mRNA靶点的表达，共发现了8种不同的状态，这可能代表了调节性T细胞的不同分化状态。下图（B）中的单细胞热图显示了在八种状态下具有差异表达的选定蛋白质和基因。根据CD45RA的逐渐丧失和HLA-DR的上调，将每种状态的细胞从左到右排列，以代表从原始细胞到活化细胞的发展。除CD45RA表达水平的差异外，还可以进一步区分这三种状态，因为CD31只在状态7细胞中表达，这与RTE的特征一致。另一方面，状态5下CD95的单独表达和CD45RA的同时下调，表示从原始细胞向凋亡敏感和活化细胞的转变。

多组学分析揭示的主要固有淋巴细胞亚群差异

通过对三个主要循环固有淋巴细胞组【通常定义为CD117−CD294−ILC1、CD117^+/−CD294⁺ILC2和CD117⁺CD294−ILC祖细胞/ILC3（ILCP/ILC3）】的手动设门，进行最初数据分析。采用单细胞AbSeq和mRNA数据，在三个固有淋巴细胞组之间进行差异表达分析，并确定每个组的独特蛋白质和mRNA特征。该分析还揭示了定义固有淋巴细胞组的关键转录因子的预期表达模式。例如，编码T-bet（TBX21）的基因仅在ILC1细胞的一个亚群中有表达，而GATA3在ILC2细胞中表达水平最高。正如最近报道的所述，RORC（编码RORγδ）部分由显示ILC3表型的循环固有淋巴细胞的祖细胞（CD117⁺CD294−ILCP/ILC3细胞）表达。

无偏细胞聚类可识别不同样品的多种细胞表型

采用上述实验产生的多组分数据和无偏聚类算法PhenoGraph SeqGeq™ 软件插件，生成了t-SNE，以便用于检测细胞群。PhenoGraph确认了四种不同组织类型的12个细胞簇。与对照细胞簇1、5、7和12相比，这12个细胞簇中有4个细胞簇的细胞密度和HFD小鼠脂肪组织分布存在显著差异。

对高脂饮食组脂肪组织CD8⁺T细胞的单核分析表明，这些细胞经历了细胞衰竭。

采用Monocle对脂肪组织CD8⁺T细胞进行了特别分析，鉴别出了五中发展状态。对照组小鼠的CD8+T细胞属于状态1和状态2，而高脂饮食组小鼠的CD8+T细胞则进一步遵循状态3、状态4和状态5的轨迹。高脂饮食组小鼠的状态2、状态3、状态4和状态5表现出衰竭标记物的高表达，如CD279（PD-1）蛋白和mRNA（Pdcd1）以及Tigit。