细胞凋亡检测 | 凋亡信号

Overview

细胞凋亡是一个细胞信号“自毁”，为维持内环境稳定而启动的程序性死亡的过程。当细胞被破坏或不再被需要时，它们就会发生凋亡或程序性细胞死亡，这是胚胎发育和组织稳态期间发生的一种正常生理过程。细胞凋亡控制受损细胞的有序死亡，而坏死是组织损伤的结果，导致受损细胞和周围细胞的损失。

细胞凋亡过程

凋亡过程，具有一定的形态学特征。包括质膜的改变（如膜对称性和附着能力的丧失）、细胞质和细胞核的浓缩、蛋白质裂解和DNA核内小体裂解。在这一过程的最后阶段，死亡的细胞分裂成凋亡小体，并且接着被吞噬细胞清除，而对周围细胞没有造成明显的炎症性损伤。

然而，一些细胞类型并不表现出凋亡的属性特征。在这种情况下，可能需要对凋亡的多个方面进行分析，以确定细胞死亡的机制。

为了支持这一研究需求，BD生物科学公司提供了全方位的凋亡检测工具和技术，用于检测凋亡过程不同阶段的指标。BD Biosciences工具使用多种方法，包括流式细胞术、生物成像和显微镜检查（用于活细胞和固定细胞分析）以及 ELISA、IHC、蛋白免疫印迹和荧光分光光度法。

Apoptosis Detection Methods

用于检测不同细胞或组织类型细胞凋亡的方法

Annexin V—细胞凋亡信号传导的关键蛋白

质膜改变是细胞凋亡过程的特征之一。细胞凋亡可以通过磷脂酰丝氨酸(PS)的存在来检测，PS通常位于质膜的细胞质表面。在细胞凋亡过程中，PS转位到质膜的外叶，当钙存在时，可通过与荧光染料标记的Annexin V结合，通过流式细胞术和细胞成像进行检测。

BD Biosciences提供几种常见形式的Annexin V，如用于紫色激光的FITC、PE、BD Horizon™ BV421和用于紫外激光的BD Horizon™ BUV395。随着这些新形式的加入，可以开发更复杂的检测方法来观察异质性细胞亚群内的细胞凋亡。

由于如果质膜受损，细胞内Annexin V也会暴露，因此通常使用膜不渗透染料（如7-AAD）区分凋亡和死亡细胞，以排除死亡细胞。Annexin V染色的细胞群仅代表凋亡细胞群。

Result of control Annexin V BD Horizon™ V450.

Result of low RF field treatment Annexin V BD Horizon™ V450.

Result of high RF field treatment Annexin V BD Horizon™ V450.

通过Annexin V-BD Horizon™ V450监测射频剂量依赖性细胞凋亡、坏死和细胞死亡。在用靶向金纳米颗粒的低剂量西妥昔单抗处理的胰腺癌细胞系中，通过Annexin V-BD Horizon™ V450检测细胞凋亡、坏死和细胞死亡。随着射频场功率增加，温度升高，观察到细胞凋亡（右下象限）向明显坏死（左上象限）的转变。

裂解的半胱天冬酶（Caspases）和PARP的测定

目前观察到的细胞凋亡最一致的特征之一是半胱天冬酶Caspases的胞质蛋白酶的激活。在细胞凋亡的最早阶段，Caspases在天冬氨酸残基裂解后被激活。活性Caspases可以切割许多蛋白质，包括多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、其他半胱天冬酶和其他蛋白底物。这导致细胞结构和功能的丧失，并最终导致细胞死亡。半胱天冬酶Caspases-9、-8和-3与细胞凋亡有关—线粒体途径中的半胱天冬酶Caspases-9、Fas/CD95途径中的半胱天冬酶-8和下游的半胱天冬酶Caspases-3，通过多种途径激活。

BD Biosciences现有多种试剂可测量半胱天冬酶Caspases，特别是半胱天冬酶-3。包括仅针对半胱天冬酶活性形式的抗体。这些抗体有多种形式，可用于流式细胞术、成像、ELISA和蛋白免疫印迹。

BD Biosciences还提供了一系列用于半胱天冬酶Caspases活性测定的工具，从单个荧光肽底物和抑制剂到试剂盒，再到即用型检测试剂盒。所有这些都是基于使用合成的四肽底物，其设计使人或小鼠半胱天冬酶的蛋白水解导致荧光团或发色团的释放。单个合成的四肽底物以及半胱天冬酶抑制剂为半胱天冬酶活性检测提供了灵活性。

BD还提供检测完整、未固定细胞中半胱天冬酶活性的试剂，用于活细胞半胱天冬酶探针的流式细胞术检测方法。由于这些探针具有细胞渗透性，因此使用前不需要固定靶细胞，可以直接与完整的、未固定的样品共同孵育，以快速检测半胱天冬酶活性。这些检测可用三种激光来简化实验设计。

使用抗活性半胱天冬酶-3抗体对凋亡和非凋亡细胞群进行流式细胞分析。Jurkat T细胞(A,A1)或小鼠胸腺细胞(B,B1)不处理(A,B)或用喜树碱(A1)或小鼠Fas单克隆抗体，克隆Jo2（产品目录号554254）处理4小时，以诱导细胞凋亡(B1)。对细胞进行透化处理，然后用PE偶联的活性Caspase-3抗体（产品目录号557091）进行染色。对于活性Caspase-3的存在，未处理细胞主要呈阴性，而诱导发生凋亡的每个细胞群中约一半的细胞可检测到活性Caspase-3。

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除了Caspase-3和Annexin V，还有其他几种对细胞凋亡研究很重要的蛋白，包括Bcl-2家族、肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族、PARP和其他信号传导分子。

Bcl-2家族都含有保守Bcl-2同源(BH3)结构域，Bcl-2家族是细胞凋亡的通用关键调节因子。例如，Bcl-2通过与线粒体膜结合，阻止线粒体释放细胞色素c，保护细胞免于凋亡。相反，其他Bcl-2家族成员，如Bax，促进细胞凋亡。据报道，癌症中Bcl-2水平升高。

TNFR家族包含许多成员，包括CD95，根据结构可分为三大类。通过TNFR途径的信号传导导致细胞凋亡。

PARPs是由DNA链断裂激活的DNA修复酶。Caspase-3将PARP裂解为24-和89-kDa片段，使PARP酶失活。

BD Biosciences携带PARP裂解产物特异性抗体，PARP裂解产物是细胞凋亡的标记物之一。这些抗体有多种格式，可以与其他标记物结合以获得关于细胞的额外信息。

Apoptosis Tools and Resources

细胞凋亡研究的其他BD Biosciences工具

有许多细胞凋亡触发因素，包括某些细胞因子、蛋白质-蛋白质相互作用和化学物质。一旦细胞凋亡开始，可使用BD^® MitoScreen (JC-1)流式细胞仪试剂盒或BD Pharmingen™ MitoStatus染料通过流式细胞术测定线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位的降低导致线粒体膜通透性增加，释放细胞色素c、半胱天冬酶原等可溶性蛋白。

DNA断裂是细胞凋亡的最后阶段之一，由凋亡过程中核酸内切酶的激活导致。DNA片段化研究有几种已建立的方法，包括琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段和末端标记。BD^® APO-BrdU™试剂盒使用末端标记或末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)缺口末端标记（TUNEL法）来支持DNA片段化的研究。在本试验中，TdT催化溴化脱氧尿苷三磷酸盐(Br-dUTP)非模板依赖性添加到双链和单链DNA的3'-羟基(OH)末端。掺入Br-dUTP后，通过用标记的抗BrdU染色细胞，使用流式细胞术鉴定双链和单链DNA的这些末端位点。相反，BrdU增殖实验将BrdU整合到新合成的DNA中，进入DNA链断裂位点。

在细胞凋亡结束时，细胞变得无活性。因此区分凋亡和坏死或死亡细胞是分离凋亡细胞群的关键。BD提供许多用于鉴定死细胞的产品，包括酯酶活性探针和膜完整性染料。

指标	实验	关键特征
质膜改变（磷脂酰丝氨酸）	Annexin V 结合试验单一结合物 Annexin V 试剂盒	检测早期细胞凋亡标记物快速简便流式细胞术或免疫荧光应用
半胱天冬酶活化（荧光分光光度法）	半胱天冬酶活性检测试剂盒和试剂	快速简便
半胱天冬酶活化（免疫分析法）	活性半胱天冬酶-3免疫测定，包括活性半胱天冬酶-3结合物	固定细胞或裂解组织中的ELISA、流式细胞术或免疫印迹分析
通过活细胞活性探针激活半胱天冬酶	活性半胱天冬酶-3活细胞半胱天冬酶探针： BD Pharmingen™黄绿色活细胞半胱天冬酶探针 BD Pharmingen™蓝色活细胞半胱天冬酶探针 BD Pharmingen™紫色活细胞半胱天冬酶探针	流式细胞仪允许在完整、未固定细胞中检测半胱天冬酶活性
关键蛋白活性	关键信号传导蛋白结合物，包括：裂解的PARP Bcl-2 CD95 H2AX	可用于流式细胞术、蛋白免疫印迹、免疫组化和免疫荧光有多种形式可供选择，允许与其他细胞凋亡和活力工具联用，以更好地表征目标群体
线粒体变化	BD^® MitoScreen试剂盒 BD Pharmingen^™ MitoStatus TMRE BD Pharmingen^™ MitoStatus Red	通过流式细胞术或荧光显微镜快速、简便、单细胞分辨率
DNA断裂	APO-BrdU^™ TUNEL法 APO-DIRECT^™ TUNEL法	与贴壁细胞一起工作，单细胞分辨率结合流式细胞术细胞周期分析
酯酶活性	BD Pharmingen^™钙黄绿素AM BD Pharmingen^™钙黄绿素蓝AM	通过流式细胞术测量完整、未固定细胞中的活力
膜完整性（核酸检测法）	碘化丙啶 7-AAD DAPI DRAQ7^™ BD Via-Probe^™绿色核酸染色剂 BD Via-Probe^™红色核酸染色剂	通过对染料具有渗透性的死亡细胞中的核酸检测，使用流式细胞术测量完整、未固定细胞中的活力可用于多种激光线，方便组合设计
膜完整性（染料排除）	>BD Horizon^™固定活力染色剂	使用流式细胞术通过对完整细胞表面和死亡细胞进行染色提供10种颜色，灵活选择