干细胞研究|干细胞疗法

Overview

干细胞自我更新和分化为其他类型细胞的能力使其在治疗应用中具有很高的价值。这种能力对于不断自我更新的组织至关重要，如血液、皮肤和肠道。干细胞存在于从胚胎（胚胎干细胞）到成年期（成体干细胞）的所有发育阶段。在发育过程中出现了几种类型的干细胞，并积极参与组织稳态¹。

干细胞和干细胞微环境

已经描述了不同类型的干细胞，包括全能、多能、寡能和单能干细胞。多能干细胞，如胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)，被广泛用于干细胞研究。ESCs在培养中可分化为胚胎发育的三个胚层。利用关键的转录因子，成熟分化的—或体细胞—细胞可以被诱导成多能干细胞，能够分化为多种类型的细胞，包括造血细胞(HSC)²。

间充质干细胞(MSCs)也是指多潜能间充质基质细胞，是间充质组织的前身，如骨、软骨等。它们调节树突状细胞的抗原呈递活性、自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性和B细胞产生抗体等几种免疫功能。由于其强大的免疫抑制功能，骨髓间充质干细胞是基于细胞的方法治疗炎症和自身免疫性疾病的潜在候选者。几项研究表明骨髓间充质干细胞也能够分化为多种组织的细胞类型3。MSC及其衍生物包括构成HSC微环境的几种类型的细胞，如周细胞、骨髓基质细胞和骨谱系细胞。MSC可以从几种成人组织（骨髓、外周血、脂肪组织）或胎儿组织中分离出来，已被用于细胞治疗研究和再生医学4。

干细胞微环境

干细胞微环境是干细胞重新分组、可以自我更新并保持在未分化状态的培养环境。通过适当的细胞信号，干细胞可以动员到需要它们的目标区域。在整个人体中已经发现了许多干细胞微环境，包括大脑中的脑室下区和颗粒下区（SVZ和SGZ）、毛囊、肠隐窝和骨髓^5,6,7。

用于干细胞研究的多色流式细胞术

流式细胞技术是一种基于既定标记物监测细胞亚群异质性的有力工具。您可以使用细胞表面或细胞内生物标记物特异性的荧光微球偶联抗体来验证干细胞是否保持了多能性。由于干细胞可分化为三种初级生殖层和分化组织，因此可以利用抗体来监测其表达模式的变化。BD Lyoplate™细胞表面标记筛选组合为发现可用于深入探讨这些细胞的表面marker提供了一种强大的方法。

BD Biosciences提供了一套多样化的工具，包括高质量的抗体、试剂盒和试剂预混液、缓冲液、方案和支持干细胞研究的仪器，用于表征、分析和分选异质性干细胞群。

参考

Zakrzewski W, Dobrzyński M, Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):68. doi:10.1186/s13287-019-1165-5
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663-676. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024
Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature Rev Immunol. 2008; 8(9):726-736. doi: 10.1038/nri2395
Vizoso FJ, Eiro N, Cid S, Schneider J, Perez-Fernandez R. Mesenchymal stem cell secretome: Toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine. Int J Mol Sci. 2017;18(9):1852. doi: 10.3390/ijms18091852
Boulais PE, Frenette PS. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 2015;125(17):2621-2629. doi:10.1182/blood-2014-09-570192
Ferraro F, Celso CL, Scadden D. Adult stem cels and their niches. Adv Exp Med Biol. 2010;695:155-168. doi:10.1007/978-1-4419-7037-4_11
Cable J, Fuchs E, Weissman I, et al. Adult stem cells and regenerative medicine-a symposium report. Ann N Y Acad Sci. 2020;1462(1):27-36. doi:10.1111/nyas.14243

Surface Staining

表面染色

BD Biosciences提供了有效的解决方案来制备干细胞，而不改变表面蛋白表位的表达

样品制备

干细胞倾向于贴壁，可以三维结构生长。为制备用于流式细胞分析的单细胞悬液，可使用酶消化或机械刮片。由于酶方法可能在消化过程中裂解或修饰一些蛋白表位，防止抗体标记，因此必须对测量的每个表面标记物进行评价。

单克隆抗体

收获细胞并移除解离缓冲液后，即可使用抗体对细胞进行染色。BD Biosciences为实验设计的灵活性提供了针对数百种干细胞标记物偶联多种荧光染料的抗体的广泛试剂选择。对于罕见事件和低密度抗原的分析，BD Horizon Brilliant Violet™染料可以增加亮度和分辨率。为了便于使用，BD Stemflow™试剂盒和鸡尾酒疗法包含用于分析或分选干细胞的标准抗体组合。

]所选干细胞和衍生物的代表性标记物

人类标记物	小鼠标记物	BD Stemflow™或其他试剂盒	产品目录号
多能干细胞（ESCs和iPSCs）
阳性: 碱性磷酸酶, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-81, TRA-1-60 阴性: SSEA-1	阳性: SSEA-1	人iPSC分选和分析试剂盒	562626
人多能干细胞分选和分析试剂盒	560461
人和小鼠多能干细胞分析试剂盒	560477
造血干细胞(HSC)
阳性: CD34, CD49f, CD90 阴性: CD38, CD45RA, 谱系*	阳性: CD150, c-Kit, Sca1 阴性: CD34, CD41, CD48, 谱系	BD Pharmingen™人细胞预混液4	562722
小鼠造血干细胞分离试剂盒	560492
间充质干细胞(MSCs)
阳性: CD44, CD73, CD90, CD105, CD146, CD271 阴性: CD11b, CD19, CD31, CD34, CD45, CD144, HLA-DR	阳性: CD29, CD44, CD90, CD105, CD106, Sca-1 阴性: CD11b, CD31, CD45, Ter-119	人MSC分析试剂盒	562245
人间充质干细胞系抗体混合液	562530
神经干细胞(NSCs)
阳性: CD15^中, CD24, CD184 阴性: CD44, CD271
神经元
阳性: CD15^低, CD24 阴性: CD44, CD184	–	人神经细胞分选试剂盒	562271
癌症
CD15, CD24, CD34, CD44, CD45, CD49f, CD166, CD326, CD338, Her-2/Neu, Lgr5	–	–	–

* 人类谱系(lin)标记物: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD56, CD235a.

造血干细胞表型

造血系统的细胞在表面标记物表达方面得到了很好的表征，表面标记物通常用于分离和表征造血过程中的细胞亚群。造血干细胞(HSC)是这些造血细胞的来源，因其可用于补充正常骨髓功能，是目前干细胞生物学的重点领域。

HSC被鉴定为表达 CD90 和 CD34¹ 的谱系阴性细胞。⁸富集能够自我更新的长期HSC池(LT-HSCs)的其他标记物包括CD38,² CD45RA,³和CD49f⁴。据报道，约10%具有Lin–CD34 + CD90 + CD45RA–CD49f + 表型的细胞能够在小鼠模型中提供长期的再增殖能力⁴。

参考

Baum CM, Weissman IL, Tsukamoto AS, Buckle AM, Peault B. Isolation of a candidate human hematopoietic stem cell population. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(7):2804-2808. doi: 10.1073/pnas.89.7.2804
Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(10):5320- 5325. doi: 10.1073/pnas.94.10.5320
Majeti R, Park CY, Weissman IL. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 2007;1(6):635-645. doi: 10.1016/j.stem.2007.10.001
Notta F, Doulatov S, Laurenti E, Poeppl A, Jurisica I, Dick JE. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 2011;333(6039):218-221. doi: 10.1126/science.1201219

Intracellular Staining

细胞内染色

细胞内染色使您能够将流式细胞术的速度和统计学相关性扩展到细胞内功能蛋白的研究。它可与表面染色结合使用，以确定关键时间点、标记物和沿特定分化途径移动的细胞比例。细胞内染色方案要求对细胞进行固定和透化处理，使抗体能够进入细胞质和细胞核。由于固定可有效杀死细胞，因此细胞内染色与活细胞分选不兼容。

样品制备

对于细胞内染色，与表面染色一样，必须使用酶或机械方法制备单细胞悬液。我们推荐。可选表面染色后，必须对细胞进行固定和透化处理，使抗体能够进入。然后用细胞内抗原的荧光标记抗体对细胞染色，并在流式细胞仪上进行分析。

为了优化透化和染色条件，BD开发了几种检测关键干细胞转录因子的试剂盒。该试剂盒包含优化的抗体和缓冲系统，以表征干细胞以及它们分化的各种谱系。

细胞类型	细胞内标记物	BD StemflowTMKit	目录号
胚胎干细胞（ESCs）诱导多能干细胞（iPSCs）	Nanog，Oct3/4，Sox2	人多能干细胞转录因子分析试剂盒	560589
小鼠多能干细胞转录因子分析试剂盒	560585
神经干细胞（NSCs）	Nestin, Pax6, Sox1, Sox2	人神经谱系分析试剂盒	561526
星形胶质细胞	GFAP	人神经谱系分析试剂盒	561526
神经元	双西环素	人神经谱系分析试剂盒	561526
早期胰腺内胚层	FoxA2, Pax6, Pdx1, Sox17	人确定性和胰腺内胚层分析试剂盒	562496
晚期胰腺内胚层	NeuroD1, Nkx6.1
心脏	Ctni、GATA4、Islet-1、肌球蛋白重链
肝脏	AFP, GATA4

干细胞分化

人类多能干细胞能够分化为各种细胞谱系是发育生物学的中心课题，具有再生医学和细胞治疗的应用。随着多能细胞分化成不同的谱系，转录因子和其他蛋白的表达会发生变化。多参数流式细胞术是测定表达感兴趣标记物的细胞相对数量的极好方法，可用于优化、定量和比较分化方案和分化潜能。

例如，在哺乳动物胚胎发育中，最终的内胚层生成肝脏、胰腺和肠道¹。在谱系特征进入确定性内胚层的过程中，转录因子Sox17和FoxA2的水平增加，而多能性标记物如Nanog减少²。

神经干细胞向神经系的分化也可以使用多色流式分析进行监测。随着神经干细胞(NSCs)分化为神经元，它们逐渐表达较少的Nestin和较多的早期神经元标记物doublecortin(DCX)。继续表达Nestin的细胞亚群进一步描绘为表达CD44的神经胶质细胞群。

快速标记物筛选

作为流式细胞术技术的领导者，BD Biosciences提供强大的工具，有效支持您的筛选工作。

干细胞生物学面临的一个主要挑战是培养和分化的异质性。为了分选活细胞以纯化用于后期实验，必须知道目标细胞的细胞表面特征。由于不同类型的相关细胞可能共享标记物，研究人员必须为每个细胞找到一个独特的多标记特征，而其他标记可能有助于区分特定类型细胞的亚群。

BD Lyoplate™细胞表面标记筛选组合为通过流式细胞术或细胞成像分析数百种人类或小鼠细胞表面标记物的干细胞及其衍生物提供了全面高效的解决方案。破译细胞表面蛋白质组使研究人员能够定义从异质性群体中分析和分离靶向细胞的策略，用于功能研究、药物筛选、体内动物研究和细胞治疗研究。

每个组合中的数百种单克隆抗体构成了可用于细胞分析的最具成本效益的筛选工具之一。为了简化向更有针对性、更大规模实验的转变，筛选组合中包括的所有抗体均可在BD Biosciences目录中获得。

人（产品目录号560747）和小鼠（产品目录号562208）组合包含三个微孔板。每个孔含有冻干、纯化的抗体，可与一种细胞表面标记物或同型对照结合。复溶后，用纯化抗体对细胞样本进行染色，并加入组合中包含的检测试剂。最后，通过流式细胞术或成像分析样本。

为了在简化工作流程的同时提供灵活性，打开孔可扩展组合以包括额外的标记。强大的BD Biosciences分析工具可促进数据挖掘和热图生成。

流式细胞术与BD Lyoplate™ 组合图像筛查的考虑因素

样品性质	流式细胞仪	成像
悬浮细胞	X
罕见细胞群	X
亚群分析  与多种标记物共染	X
报告线	X	X
特定形态变化		X
细胞数量有限		X

参考

Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.  2008;132(4):661-680. doi: 10.1016/j.cell.2008.02.008
D’Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E, Baetge EE. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005;23(12):1534-1541. doi: 10.1038/nbt1163

Screening

Screening of neural populations

神经群筛选

来源于多能干细胞的神经细胞群对于研究人类疾病和发育具有重要意义。多能干细胞可分化为自我更新的NSCs，可进一步分化为异质性的神经元和神经胶质细胞群¹。进一步研究的一个关键是确定这些细胞类型中每一种的表面标记特征。

在下面的示例中，BD Lyoplate™人细胞表面标记筛选组合（产品目录号560747）用于鉴定NSCs和神经元的细胞表面表型。在图A中，通过流式细胞术筛选异质性神经诱导培养物，并在热图上鉴定潜在的NSC标记物。使用细胞内NSC标记验证获得的CD184 + CD44–CD271–CD24 + CD15^中的NSC细胞表面表型。表面表型用于分选接近纯的NSCs亚群，随后证实了其在体内和体外的分化能力。

在图B中，纯化的NSCs分化为神经元和神经胶质细胞群，使用相同的组合通过成像进行筛选，以鉴定分离神经元的表面标记物。由于神经元的独特形态和与神经元特异性标记物共染色的能力，选择了成像筛选。通过流式细胞仪验证潜在的CD44–CD184–CD24 + CD15^低神经元表面表型，并用于纯化神经元。除了神经细胞，BD Lyoplate™人细胞表面标记筛选组合也被用于鉴定多能干细胞来源的心肌细胞的细胞表面标记²。这种强大的方法被用来开发阿尔茨海默病的人类干细胞模型³。

The purified NSCs were differentiated into neuronal and glial cell populations, which were screened by imaging using the same panel to identify surface markers for isolating neurons. An imaging screen was chosen due to the unique morphology of neurons and the ability to co-stain with a neuronal-specific marker. A potential neuronal surface phenotype of CD44^–CD184^–CD24⁺CD15^low was verified by flow cytometry and used to purify neurons. In addition to neural cells, the BD Lyoplate™ Human Cell Surface Marker Screening Panel has also been used to identify cell surface markers of cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells.² This powerful methodology was used to develop a human stem cell model of Alzheimer’s disease.³

参考

Yuan SH, Martin J, Elia J, et al. Cell surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLoS One. 2011;6(3):e17540. doi: 10.1371/journal.pone.0017540
Uosaki H, Fukushima H, Takeuchi A, et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 2011;6(8):e23657. doi: 10.1371/journal.pone.0023657
Israel MA, Yuan SH, Bardy C, et al. Probing sporadic and familial Alzheimer’s disease using induced pluripotent stem cells. Nature. 2012;482(7384):216-220. doi: 10.1038/nature10821

Resources

仅供研究使用，不用于诊疗程序。

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