Multicolor 유세포 분석은 관심있는 다양한 세포 subpopulation에 대한 신속한 multiparametric분석을 제공합니다. 응용 분야에는 면역학, 면역 종양학, 바이러스학, 면역 모니터링 등 여러 분야가 포함됩니다. BD Biosciences는 모든 laser 라인에서 혁신적인 dye를 개발하여panel design 유연성과 포괄적인 접합 항체 포트폴리오를 제공하여 표면, 세포 내 또는 secreted marker의 심층 특성분석을 지원합니다. 단순한 연구에서부터 복잡한 연구 응용 분야에 이르기까지 유세포 분석기 및 분류기에서 광범위한 시약 선택과 포괄적인 educational resources, tools 그리고 protocols, 을 제공하여 multicolor 유세포 분석 워크플로우 여정을 효율적으로 진행할 수 있도록 지원합니다.
Multicolor유세포 분석의 원리
유세포 분석은 세포 단위로 세포 집단을 분석합니다. 이 기능은 샘플 내 많은 세포 중에서 매우 적은 수의 세포를 찾고 있는 오늘날의 연구자 및 임상의에게 중요한 기능으로(예 : 건초 더미에서 바늘 찾기) 질병 상태 또는 생물학적 과정을 연구를 가능하게 합니다. 둘째, 유세포 분석은 매우 빠릅니다. 일상적인 샘플 분석 속도는 초당 최대 10,000 개의 세포에 이를 수 있습니다. 이는 세포를 시각적으로 검사하고 계수하는 기존 방법에 비해 놀라운 발전입니다. 마지막으로, 유세포 분석은 single cell의 여러 parameters (multiplexing)를 동시에 측정할 수있는 능력이 있습니다. Multiplexing을 통해 연구자와 임상의는 이전보다 빠르게 single sample 더 많은 정보를 수집할 수 있습니다. 이러한 기능 덕분에 연구원과 임상의에게 있어 유세포 분석은 다양하게 응용될 수 있는 강력한 도구가 되었습니다.
유세포 분석의 작동 원리
유세포 분석기에는 fluidics, 광학 및 전자의 세 가지 주요 시스템이 있습니다.
Fluidics system 은 세포 샘플 (예: 인간 혈액 샘플)을 단일 스트림으로 funneling하여 세포가 한 번에 하나씩 laser 빔을 통과하도록 합니다. 각 세포는 빔을 통과할 때 빛을 산란 시키고 형광 빛을 방출할 수 있습니다. 이러한 광 신호는 광학시스템에 의해 수집되어 다양한 detector로 전달됩니다. detector에 의해 수신된 신호는 전자 시스템에 의해 숫자 값으로 변환됩니다. 결과는 화면에 표시하거나 특별히 설계된 소프트웨어를 사용하여 향후 분석을 위해 저장할 수 있습니다.
각 세포가 빔을 통과할 때 해당 parameter(특성)가 빔을 통과 한 시간과 함께 측정 및 기록됩니다. 일반적으로 샘플 당 최소 10,000 개의 세포에 대한 데이터가 수집됩니다.
Sorting
먼저 유세포 분석기가 관심 대상세포를 식별할 수 있도록 parameter를 설정합니다. 샘플을 포함하는 fluid 흐름은 fluidics system 에 의해 고압에서 단일 흐름으로 유입되어 세포에 대한 정보가 측정되는 laser 빔을 통해 한 번에 하나씩 통과합니다. 세포가 지정된 parameter와 일치하면 세포계는 여기에 전하를 적용합니다. 이는 전하를 띄는 세포가 수집 튜브쪽으로 편향되게 합니다. 그후 연구원은 관심대상 세포를 가져와 배양에서 성장시키거나 다른 분석에서 연구할 수 있습니다. 전하를 띄지 않은 물방울은 계속해서 폐기물 용기로 흘러갑니다. 이 프로세스는 초당 최대 20,000 셀의 속도로 신속하게 수행될 수 있습니다.
실험에 가장 적합한 세포 분류기를 찾아보세요. BD Biosciences는 간단한 벤치탑 시스템에서 완전히 구성 가능한 고급 시스템에 이르기까지 다양하게 적용될 수 있는 연구용 세포분류기 를 제공합니다.
세포 특성 측정
세포가 laser 빔을 통과하면 빛이 다른 방향으로 산란됩니다. 빛이 산란되는 양과 방향을 측정하면 연구자들이 세포의 크기와 내부 복잡성을 모두 결정할 수 있습니다. 유세포 분석을 사용하면 한 번에 하나 이상의 세포 집단을 연구할 수 있으며, 세포 크기와 복잡성 이상의 정보를 얻을 수 있습니다.
세포 및 세포 활동의 marker로서의 fluorescence
Monoclonal antibodies 는 종종 laser에 의해 excited될 때 형광을 방출하는 형광 dye(형광 색소)와 연결됩니다. 형광 색소는 항체 또는 marker에 결합된 세포를 추적할 수 있도록 합니다. 대부분의 세포는 자연적으로 fluorescence light를 방출하지 않습니다. 그러나 형광 색소 태그가 붙은 monoclonal antibodies 가 세포에 존재하는 항원에 결합된 경우, 해당 세포가 유세포 분석기의 laser 빔을 통과할 때 형광 신호가 포착됩니다.
형광색은 방출할 빛의 색상에 따라 서로 다릅니다. 예를 들어 BD가 제공하는 형광색소 중 하나인 FITC는 green light를 방출하는 반면 BD가 제공하는 다른 형광 색소 중 하나인 PE는 유세포 분석기에서 사용되는 레이저에 노출될 때 orange light를 방출합니다. 서로 다른 형광색소를 사용하면 연구자들이 세포 집단이나 다른 세포 활동을 구별하는데 도움이 됩니다.
Fluorescence as a marker of cells and cellular activities
| Fluorochrome | Em-Max(nm) |
|---|---|
| BD Horizon™ BUV395 | 395 |
| BD Horizon™ BV421 | 423 |
| BD Horizon™ V450 | 450 |
| BD Pharmingen™ Pacific Blue™ | 455 |
| BD Horizon™ BV480 | 479 |
| BD Horizon™ BUV496 | 496 |
| BD Horizon™ V500 | 499 |
| BD Horizon™ BV510 | 512 |
| BD Horizon™ BB515 | 515 |
| Alexa Fluor™ 488 | 517 |
| BD Pharmingen™ FITC | 518 |
| BD Horizon™ BUV563 | 564 |
| BD Horizon™ BV570 | 573 |
| BD Pharmingen™ PE | 576 |
| BD Horizon™ BYG584-P | 583 |
| BD Horizon™ BV605 | 605 |
| BD Horizon™ BB630-P2 | 614 |
| BD Horizon™ BUV615 | 615 |
| BD Horizon™ PE-CF594 | 615 |
| BD Horizon™ BV650 | 649 |
| BD Horizon™ BUV661 | 660 |
| Fluorochrome | Em-Max(nm) |
|---|---|
| BD Horizon™ BB660-P2 | 660 |
| BD Pharmingen™ APC | 660 |
| BD Pharmingen™ Alexa Fluor™ 647 | 669 |
| BD Pharmingen™ PE-C5 | 670 |
| BD Pharmingen™ PerCP | 675 |
| BD Pharmingen™ PerCP-Cy5.5 | 676 |
| BD Horizon™ BB700 | 695 |
| BD Horizon™ APC-R700 | 706 |
| BD Horizon™ BV711 | 713 |
| BD Horizon™ Red 718 | 718 |
| BD Pharmingen™ Alexa Fluor™ 700 | 719 |
| BD Horizon™ BUV737 | 735 |
| BD Horizon™ BV750 | 754 |
| BD Horizon™ BB755-P | 755 |
| BD Pharmingen™ APC-Cy7 | 779 |
| BD Pharmingen™ PE-C7 | 781 |
| BD Pharmingen™ APC-H7 | 782 |
| BD Horizon™ BV786 | 786 |
| BD Horizon™ BV790-P | 790 |
| BD Horizon™ BUV805 | 803 |
BUV, BD Horizon Brilliant™ UV; BV, BD Horizon Brilliant Violet™; BB, BD Horizon Brilliant™ Blue; BYG, BD Horizon Brilliant™ Yellow-Green; -P, prototype dyes.
Multicolor 유세포 분석
서로 다른 유형의 세포는 서로 다른 조합의 항원을 보유하고 서로 다른 조합의 항체와 결합할 것입니다. 세포 샘플을 테스트하는데 사용되는 각 monoclonal antibody 가 다른 형광 색소에 연결되어 있는 경우, laser 빔을 통과할 때 방출되는 색상의 조합으로 세포 유형을 구별할 수 있습니다.
여러 형광 색소의 조합을 동시에 사용하면 서로 다른 세포 집단을 구별하는 능력이 더욱 향상됩니다. 아래 그림은 T 림프구를 찾기 위한 세포 샘플 시험에서 각각 다른 형광색소에 연결된 두 개의 다른 monoclonal antibodies 를 사용한 예입니다. 네 가지 유형의 세포가 분명하게 나타났습니다.
유세포 분석은 형광 기술의 유연성과 민감도를 고속 및 데이터 통합 기능과 결합합니다. 이는 세포 분석의 황금 표준이 되었으며 현재 생명 과학의 수많은 분야에서 분석 도구로 사용되고 있습니다.
Intracellular 유세포 분석
Intracellular 유세포 분석은 세포 유형을 식별하고 세포 주 및 이종 세포 샘플 내에서 신호 및 기능적 반응을 분석하는 강력한 기술입니다. BD Biosciences는 세포 내 유세포 분석을 용이하게하기 위해 다양한 시약, 키트 및 프로토콜 을 제공합니다. 세포 내 cytokine staining, 인 단백질 및 세포 내 유세포 분석을 통한 전사 인자 측정을 지원하는 BD fluorochrome-conjugated 항체, buffer, 키트 및 프로토콜을 포함한 도구와 기술을 찾아보십시오.
Multicolor 유세포 분석을 위한 BD Biosciences 도구
유세포 분석 장비
유세포 분석의 선구자로서 당사는 유세포 분석 장비 개발에 앞장서왔습니다. 당사는 연구를 지원하기 위해 포괄적인 연구용 cell analyzers 와 cell sorters 를 제공합니다.
Laser및 dye
Laser 는 세포의 크기와 복잡성에 대한 정보를 제공하고 세포의 기능을 식별하고 이해할 수있는 항원 특이적 항체에 결합된 형광색소를 자극합니다. Multicolor유세포 분석의 힘을 최대한 활용하려면 사용할 형광색을 이해하고, 다양한 형광색의 스펙트럼 특성을 비교하고, 분석해야 하는 parameter 수에 따라 올바른 장비를 결정하는 것이 중요합니다. 당사는 multicolor 유세포 분석을 위해 모든 laser line에서 다양한 형광 색소를 제공합니다. 실험에 적합한 형광 색소를 선택할 수 있도록 excitation/emission스펙트럼, 필터 권장 사항 및 상대적 resolution정보와 같은 속성을 사용하여 dye를 보고 비교할 수 있는 fluorochrome atlas 를 개발했습니다.
BD OptiBuild ™ 주문형 시약
BD OptiBuild™ 주문형 시약을 사용하면 계속해서 확대되는 dye 조합 카탈로그에서 필요한 항체에 쉽게 접근할 수 있습니다. BD OptiBuild ™ 시약은 새로운 형광색을 평가 및 추가하고 panel design을 단순화할 수 있도록 유연성을 제공합니다.
프로토콜 및 리소스
프로토콜
실험에 적합한 프로토콜을 찾을 수 있도록 프로토콜 repository 를 개발했습니다. 이곳에서 유세포 분석 워크플로우를 지원하는 단계별 가이드, 유용한 권장 사항 및 기타 리소스를 찾을 수 있습니다.
Panel design 리소스 및 도구
Multicolor panel design, 워크플로우 및 실험 분석을 지원하는 데 유용한 도구와 리소스를 찾아보세요
BD Horizon Brilliant™ Dyes
BD Horizon Brilliant™ Dyes는 Sirigen Ltd에서 인수한 선구적인 폴리머 dye 기술로부터 개발되었습니다. 이러한 고유한 dye는 동일한 background에서 기존 dye보다 밝기 때문에 현장에서 획기적인 발전을 이룰 수 있습니다.
표면에 수용체가 거의 없는 세포의 경우 샘플에서 dim cell을 분리하는데 밝은 시약이 필수적입니다. BD Horizon Brilliant ™ Polymer Dyes 는 경우에 따라 기존의 유기 형광 염료 또는 PE 또는 APC와 같은 phycobiliprotein보다 훨씬 더 밝은 형광 신호를 얻을 수 있습니다. 이는 기존보다 더 넓은 범위의 수용체 밀도를 가진 세포 집단을 식별하는 데 효과적이라는 것을 의미합니다.
BD Horizon Brilliant ™ Dyes 는 성공적인 기술을 기반으로 합니다.
2000 년에 전자 및 디스플레이 산업에 혁명을 일으키고 있는 독특한 종류의 전도성 고분자 재료를 발견한 공로로 노벨 화학상이 수여되었습니다. BD Horizon Brilliant ™ Polymer Dyes는 excitation light를 수집하고 이를 더 긴 파장에서 방출된 빛으로 효율적으로 변환하는데 효과적인 매우 광안정성 폴리머 dye를 생성할 수 있는 특허받은 화합물을 기반으로 합니다.
이러한 우수한 폴리머 reporter는 핵산 프로브 및 항체에 부착되어 다양한 분석 및 응용에 사용할 수 있습니다. 민감도를 위해 측정 신호를 상당히 증가시킬 수 있습니다(최대 100 배).
신호 증폭
BD Horizon Brilliant ™ Dye polymer 체인은 광학 세그먼트 모음으로 볼 수 있습니다. 폴리머 사슬의 각 세그먼트는 빛을 흡수할 수 있으므로 매우 큰 흡광 계수(또는 빛의 광자를 흡수할 확률)를 가질 수 있는 물질이 생성됩니다.
이러한 재료에 내재된 electronic delocalization 의 결과 에너지는 확장된 체인을 따라 이동할 수 있습니다. 따라서 중합체에 의해 수확된 모든 빛은 fluorescence resonance energy transfer (FRET) 과정을 통해 저에너지의 밀접하게 연관된 형광 수용체로 전달되거나, dye를 사용하지 않는 경우 중합체 자체에 의해 형광으로 방출될 수 있습니다. Collective molecular antenna–like behavior는 이러한 기술과 지적재산 기반의 토대입니다.
Reporter dye와 결합된 이 폴리머는 뛰어난 스톡스 시프트 (Stokes shift)로 tandem 염료를 생성하는 donor 역할도 할 수 있습니다.
Base Polymer Dyes 및 Polymer Tandem Dyes
이렇게 두 가지 형식으로 제공됩니다.
Base polymer dye는 가장 간단한 형식이며, 광안정성이 매우 높고 기존 형광 dye에 비해 밝습니다. 이들은 excitation light(분자 안테나와 같은)을 수집하고 이를 더 긴 파장의 방출광으로 효율적으로 변환시킵니다.
Polymer Tandem dye는 기본 폴리머 (donor) dye와 두 번째 일반 형광 (acceptor) dye라는 두 가지 dyes 분자로 구성됩니다. 분자는 화학적으로 서로 연결되어 donor의 excitation 파장에서 excited되고 acceptor의 방출 파장에서 방출되는 tandem dye를 형성합니다. 이 tandem dye는 기존 tandem dye에 비해 매우 밝습니다.
이 기술의 향후 목표 중 하나는 더욱 쉽게 multiplexing 이 가능한 base polymer dye와 polymer tandem dye를 설계하여 multicolor 유세포 분석을 수월하게 하는 것입니다.
샘플 데이터
최신 BD Horizon Brilliant ™ Dyes에 대한 데이터 보기.
연구용입니다. 진단용 또는 치료용으로 사용할 수 없습니다.
Alexa Fluor 및 Pacific Blue는 Life Technologies Corporation의 상표입니다.
Cy는 Global Life Sciences Solutions Germany GmbH 또는 Cytiva로 사업을 하는 계열사의 상표입니다.
