Single-Cell Multiomics

건강한 샘플과 질환군 샘플의 multiomic analysis

위에서 설명한 workflow에서 생성된 데이터를 분석하기 위해 mRNA 발현, 표면 단백질 발현 또는 둘 모두의 조합을 사용하여 4 개의 CLL 샘플과 3 개의 건강한 donor 샘플에서 t-SNE 분석을 수행했습니다. AbSeq 데이터를 기반으로 생성된 t-SNE plot은 RNA-Seq 데이터를 단독으로 사용하는 것에 비해 다른 샘플들 간에 더 높은 수준의 분리를 보여주었습니다. mRNA와 AbSeq 데이터의 조합은 서로 다른 샘플의 resolution을 크게 향상시켰습니다. 4 개의 CLL 샘플 별개의 cluster를 형성한 반면, 건강한 샘플은 t-SNE plot에서 더 많이 중첩되어 CLL 환자의 clinical course가 heterogeneous할 수 있음을 시사합니다. 이러한 결과 또한 single-cell profile 분석에서 multiomics의 힘을 보여주는 것입니다.

건강한 샘플과 CLL 샘플에서 차별적으로 발현된 marker 분석

건강한 샘플과 CLL 샘플을 구별하는 clustering의 기초가 되는 marker를 이해하기 위해 single-cell mRNA 및 AbSeq 데이터를 사용하여 differential expression 분석을 수행했습니다. 이 분석은 건강한 샘플 (그룹 1)에 비해 CLL 샘플에서 marker가 감소했음을 나타냈습니다. 모든 CLL 샘플에서 차등적으로 증가된 유전자 또는 단백질은 그룹 2 (모든 CLL)에 나열되고 그룹 3에는 일부 CLL 샘플에 있는 유전자 또는 단백질이 나열됩니다. CLL 환자에서 비정상적으로 발현되는 marker인 CD5는 다른 샘플에 비해 CLL03 및 CLL04에서 더 높게 나타났습니다. 또한 CD11c와 같이 CLL04 (그룹 4)와 밀접하게 관련된 marker의 subset도 발견되었습니다. 모든 세포가 동일한 수준에서 CD11c를 생산하는 것은 아니므로 CLL의 종양내 heterogeneity가 존재함을 시사합니다.

T cell 분석

 샘플에 대해 고유한 cluster로 분리가 되었고,  단백질만, mRNA 만 또는 둘의 조합을 기반으로 한 cluster 에 대해 모두 동일 resolution 을 보입니다. 일시적 자극이 가해진 세포 cluster (14 일차)는 fresh T cell과 만성적으로 자극된 세포로부터 모두 구별되며, 이전 관찰과는 대조적으로 뚜렷한 특징을 보입니다. 또한 표현형 및 기능이 fresh cell과 유사함을 의미합니다. 만성적으로 자극된 세포 (3 일, 7 일 및 14 일)는fresh cell과 ​​분리된 cluster를 형성합니다. 세 개의 샘플은 서로 다른 cluster를 형성하여 각각 고유한 signature가 있음을 나타냅니다.

BD^® AbSeq Marker 데이터와 유세포 분석의 일치

CD8 T 세포 발현 marker의 백분율과 유세포 분석 및 AbSeq 에 의해 측정된 세포 표면 marker 에서 볼 수 있듯 단백질 발현의 동역학은 일관되게 나타났습니다.  이 데이터에서 단백질 발현을 연구하기 위한 두 기술의 일관성과 유용성이 확인되었습니다.

Monocle 분석에 의한 Treg 분화 특성 분석

Unsupervised high-dimensional 데이터 분석은 Treg subset의 식별을 개선하는 데 사용되었습니다. single-cell trajectory analysis와 differentiation process 의 transitional states 를 확인하기 위해 Monocle algorithm이 사용되었습니다. 22 개의 단백질과 399 개의 mRNA 표적의 발현에 기초하여, 8 가지 상태가 확인되었으며, 이는 Tregs의 뚜렷한 분화 상태를 나타내는 것으로 보입니다. 아래 그림 (B)의 single-cell heat map은 8 가지 상태에서 차별적으로 발현된 단백질과 유전자를 표시합니다. CD45RA의 점진적 손실 및 HLA-DR의 upregulation을 기반으로 각 상태에 속하는 세포를 왼쪽에서 오른쪽으로 정렬하여 naïve 세포에서 활성화된 세포로의 진행을 나타냅니다. CD45RA 발현의 차등 수준 외에도 CD31이 RTE의 signature과 일치하는 상태 7 세포에서만 독점적으로 발현되기 때문에 이 세 가지 상태를 더욱 확실히 구별할 수 있습니다. 다른 한편으로, 상태 5에서 CD95의 배타적 발현과 CD45RA의 concurrent downregulation은 naïve 세포에서 apoptosis에 민감하고 활성화된 세포로의 전환을 시사하는 것일 수도 있습니다.

Multiomic 분석에 의해 밝혀진 주요 ILC subgroup의 차이

처음에는 CD117- CD294- ILC1, CD117 +/- CD294 + ILC2 및 CD117 + CD294- ILC progenitors / ILC3 (ILCP / ILC3)로 정의된 순환 ILC의 세 가지 주요 그룹을 수동으로 gating하여 데이터 분석을 수행했습니다. Single-cell AbSeq 및 mRNA 데이터를 사용하여 3 개의 ILC 그룹 간에 차등 발현 분석을 수행하고 각 그룹에 대한 고유한 단백질 및 mRNA  signature를 확인했습니다. 이 분석에서는 ILC 그룹을 정의하는 주요 전사 인자에 대한 예상 발현 패턴이 나타났습니다. 예를 들어, T-bet (TBX21)을 암호화하는 유전자는 ILC1 세포의 subset에서만 독점적으로 발현된 반면 GATA3는 ILC2 세포에서 최고 수준으로 발현되었습니다. 최근 보고된 바와 같이, RORγδ를 암호화하는 RORC는 ILC3 표현형 (CD117 + CD294-ILCP / ILC 3 세포)을 나타내는 circulating ILC 전구 세포에 의해 부분적으로 발현되었습니다.

편향되지 않은 세포 cluster링은 여러 샘플에서 여러 세포 표현형을 식별합니다.

t-SNE는 데이터 관찰을 위해 위의 실험에서 생성된  multiomic data와 세포 집단 측정을 위해 unbiased clustering algorithm PhenoGraph, SeqGeq™ Software plug-in 을 이용하여 생성했습니다. PhenoGraph는 네 가지 다른 조직 유형에 걸쳐 12 개의 세포 cluster를 식별했습니다. 12 개의 cluster 중 4 개는 control cluster 1, 5, 7 및 12와 비교하여 HFD 마우스의 지방 조직에서 세포 밀도 및 분포의 차이를 보여주었습니다.

HFD 지방 조직에서 CD8 + T cell의 Monocle 분석은 이러한 세포가 세포 고갈을 겪었음을 시사합니다.

Monocle을 사용한 지방 조직의 CD8 + T cell 특정 분석은 5 가지 발달 상태를 구별했습니다. Control 마우스의 CD8 + T cell은 상태 1 및 2에 속한 반면 HFD 마우스의 세포는 상태 3, 4 및 5로 이동했습니다. HFD 마우스의 상태 2, 3, 4 및 5는 Tigit뿐만 아니라 CD279 (PD-1) 단백질 및 mRNA (Pdcd1)와  같은 marker에서도 exhaustion 발현이 증가했습니다.