Single-Cell Multiomics

BD Rhapsody ™ Single-Cell Analysis System 은 high-throughput single-cell multiomic 분석을 가능하게 하며 품질 모니터링 기능을 갖춘 microwell 기반 장비 플랫폼, BD Rhapsody ™ Whole Transcriptome Assay, BD Rhapsody ™ Targeted mRNA Panels 및 BD Rhapsody ™ TCR / BCR Profiling Assays와 같은 RNA 및 단백질assay,  software도구를 포함합니다.  BD Rhapsody ™ System은 형광으로 활성화하는 cell sorting 과 같은 BD의 upstream cell enrichment 기술과 원활하게 작동하여 사용자가 관심대상 세포를 선택하여 집중 연구할 수 있도록 해줍니다. BD single-cell multiomic 기술은 면역학 및 면역 종양학 연구에서 대사 질환의 분자생물학적 이해에 이르기까지 광범위한 연구 분야를 포함합니다. BD Rhapsody ™ Platform 은 연구자들이 심층 연구를 위해 multiomics tool을 적용할 수 있도록 토대를 마련했습니다. 아래 내용은 BD Rhapsody™ Platform을 이용하여 만들어진 주요  application 데이터를 나타낸 것입니다.

만성 림프구성 백혈병 표현형

만성 림프구성 백혈병 (CLL)은 성인에서 가장 흔한 형태의 백혈병이며 혈액과 골수에서 기능적으로 무능한 림프구가 점진적으로 축적되는 특징이 있습니다. 최근 bulk RNA sequencing 연구는 CLL 샘플 내에 heterogeneity가 있음을 시사하여 transcriptional profile 분석에 있어 single-cell RNA sequencing이 필요함을 보여줍니다. 다음은 BD Rhapsody ™ Single-Cell Analysis System을 사용하여 임상 CLL 샘플의 single-cell에서 유전자와 단백질 발현을 동시에 분석하는 방법을 예시로 나타낸 것입니다.

실험 개요

총 3 명의 건강한 기증자와 4 개의 CLL 샘플에서 얻은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 BD^® Single-Cell Multiplexing Kit 시약, 형광 색소 표지 항체 및 33 개의 BD^® AbSeq Markers로 동시에 염색했습니다. 그런 다음 BD FACSMelody ™ Cell Sorter를 사용하여 서로 다른 샘플의 CD19 + 세포를 분류하고 BD Rhapsody ™ System에 로딩하기 전에 함께 모았습니다. Library 준비를 위해 cDNA는 sequencing 전에 targeted BD Rhapsody ™ Immune Response Panel (399개의 유전자)을 사용하여 합성 및 처리되었습니다. BD Rhapsody™ Analysis Pipeline and SeqGeq™ v1.6 Software를 사용하여 데이터를 분석했습니다.

건강한 샘플과 질환군 샘플의 multiomic analysis

위에서 설명한 workflow에서 생성된 데이터를 분석하기 위해 mRNA 발현, 표면 단백질 발현 또는 둘 모두의 조합을 사용하여 4 개의 CLL 샘플과 3 개의 건강한 donor 샘플에서 t-SNE 분석을 수행했습니다. AbSeq 데이터를 기반으로 생성된 t-SNE plot은 RNA-Seq 데이터를 단독으로 사용하는 것에 비해 다른 샘플들 간에 더 높은 수준의 분리를 보여주었습니다. mRNA와 AbSeq 데이터의 조합은 서로 다른 샘플의 resolution을 크게 향상시켰습니다. 4 개의 CLL 샘플 별개의 cluster를 형성한 반면, 건강한 샘플은 t-SNE plot에서 더 많이 중첩되어 CLL 환자의 clinical course가 heterogeneous할 수 있음을 시사합니다. 이러한 결과 또한 single-cell profile 분석에서 multiomics의 힘을 보여주는 것입니다.

AbSeq 분석으로 확인된 주요 단백질 marker의 차이

CLL은 CD5 + B 림프구의 clonal expansion 및 축적하는 특징을 가지고 있습니다. 또한 CLL 환자의 악성 B 세포는 CD11c를 더 높은 수준으로 발현할 수도 있습니다. BD^® AbSeq Reagents는 건강한 기증자에 비해 CLL 샘플에서 CD11c 및 CD5가 더 높은 발현을 나타내어 CLL의 병인과의 관련성을 보여줍니다. 반면, 건강한 기증자에 비해 CLL 샘플에서 낮은 CD10 및 CD20 발현이 관찰되었으며 이는 기존 문헌과 일치하는 결과입니다.

건강한 샘플과 CLL 샘플에서 차별적으로 발현된 marker 분석

건강한 샘플과 CLL 샘플을 구별하는 clustering의 기초가 되는 marker를 이해하기 위해 single-cell mRNA 및 AbSeq 데이터를 사용하여 differential expression 분석을 수행했습니다. 이 분석은 건강한 샘플 (그룹 1)에 비해 CLL 샘플에서 marker가 감소했음을 나타냈습니다. 모든 CLL 샘플에서 차등적으로 증가된 유전자 또는 단백질은 그룹 2 (모든 CLL)에 나열되고 그룹 3에는 일부 CLL 샘플에 있는 유전자 또는 단백질이 나열됩니다. CLL 환자에서 비정상적으로 발현되는 marker인 CD5는 다른 샘플에 비해 CLL03 및 CLL04에서 더 높게 나타났습니다. 또한 CD11c와 같이 CLL04 (그룹 4)와 밀접하게 관련된 marker의 subset도 발견되었습니다. 모든 세포가 동일한 수준에서 CD11c를 생산하는 것은 아니므로 CLL의 종양내 heterogeneity가 존재함을 시사합니다.

Exhausted T cell의 심층 특성분석

T cell과 같은 세포 유형의 활성화 및 exhaustion의 기초를 이해하는 것이 이제 면역 요법 개발의 기초가 되었습니다. CAR-T 요법과 같이 빠르게 발전하는 면역 요법의 영역에서 이러한 이해는 더욱 중요해지고 있습니다. CAR-T cell의  clinical production 핵심 단계는 engineered T cell을 부풀리는 것입니다. 치료 제품을 위한 충분한 세포를 생성하려면 세포를 만성적으로 자극해야 하므로 T cell exhaustion을 유도하고 치료 효능을 감소시킬 위험이 높아집니다. CAR T cell yield, 기능 및 지속성을 최적화하기 위해 T cell expansion을 위한 프로토콜이 개발됨에 따라 T cell 정체성에 대한 in vitro manipulation의 영향에 대한 근본적인 질문을 이해하는 것이 중요합니다.  이러한 내용을 염두에 두고, 아래 연구에서는 보통 사용되는 T cell 활성화 모델을 사용한 single-cell multiomic 분석으로 이러한 기본적인 질문에 대한 해답을 찾을 수 있는지를 보여줍니다.

실험 설계

PBMC에서 얻은 magnetically enriched T cell을 IL-2 및 CD3 / CD28 Dynabeads ™ Magnetic Beads 로 3 일 동안 자극했습니다.  이후 추가로 11일 동안 만성적인 자극이 주어졌습니다. Dynabeads ™ Magnetic Beads를 제거하고 추가 11 일 동안 IL-2의 존재 하에서 세포를 배양하여 일시적인 자극을 주었습니다. 총 5 개의 샘플을 수집하고 동결했습니다. 즉, fresh한  T cell, 3 일, 7 일 및 14 일 동안 자극한 cell (만성 자극), 3 일 동안 자극된 cell 및 11 일 동안 휴식 (일시적 자극)한 cell입니다.

각 time point에서 2 개의 aliquots를 만들었습니다. 각 샘플의 한aliquot을 해동하고 39 개의 BD^® AbSeq Antibodies 및 BD^® Single-Cell Multiplexing Antibodies로 염색했습니다. 샘플을 모아 두 개의 BD Rhapsody ™ Cartridges (~ 3,000 cell / 샘플)에 로딩했습니다. BD Rhapsody ™ T- Cell Targeted Panel을 사용하여 이들 샘플에서 mRNA 발현 수준을 평가했습니다. 냉동 세포의 두 번째 aliquot를 12-color 유세포 분석 panel로 염색하고 BD LSRFortessa ™ X-20 Cell Analyzer에서 분석했습니다.

T cell 분석

 샘플에 대해 고유한 cluster로 분리가 되었고,  단백질만, mRNA 만 또는 둘의 조합을 기반으로 한 cluster 에 대해 모두 동일 resolution 을 보입니다. 일시적 자극이 가해진 세포 cluster (14 일차)는 fresh T cell과 만성적으로 자극된 세포로부터 모두 구별되며, 이전 관찰과는 대조적으로 뚜렷한 특징을 보입니다. 또한 표현형 및 기능이 fresh cell과 유사함을 의미합니다. 만성적으로 자극된 세포 (3 일, 7 일 및 14 일)는fresh cell과 ​​분리된 cluster를 형성합니다. 세 개의 샘플은 서로 다른 cluster를 형성하여 각각 고유한 signature가 있음을 나타냅니다.

Single-cell 수준에서 단백질과 유전자 발현의 상관 관계 분석

백질과 mRNA signature를 다른 population에서 분석한 결과 몇 가지 내용이 확인되었습니다. 단백질과 mRNA 발현이 서로 다른 시점에 걸쳐 강한 상관 관계를 나타내는 CD7과 같은 marker가 있습니다. CD103 (ITGAE) mRNA는 활성화 3 일째에 upregulated 된 반면, 단백질 발현은 7 일째에 증가했습니다. 만성적으로 자극된 세포에서 CD38 mRNA는 3 일째에 upregulated되었고 시간이 지남에 따라 증가하는 반면 단백질 발현은 14 일째에 증가했습니다. 일시적 자극이 가해진 세포에서는 mRNA 발현이 유지되지 않았음에도 불구하고 14 일째에 CD38 단백질이 발현되었습니다.

BD^® AbSeq Marker 데이터와 유세포 분석의 일치

CD8 T 세포 발현 marker의 백분율과 유세포 분석 및 AbSeq 에 의해 측정된 세포 표면 marker 에서 볼 수 있듯 단백질 발현의 동역학은 일관되게 나타났습니다.  이 데이터에서 단백질 발현을 연구하기 위한 두 기술의 일관성과 유용성이 확인되었습니다.

Single-cell multiomic 분석을 통한 regulatory T cells의  포괄적인 특성 분석

Regulatory T cells (Tregs)은 면역 항상성을 유지하는 데 필수적인 역할을 하며 그 변화는 종양 진행 또는 자가 면역 질환의 발병을 포함하여 많은 영향을 미칠 수 있습니다. Tregs는 기능적으로 균질한 집단이 아니며 CD45RA 및 HLA-DR의 발현을 각각 naïve 또는 active Tregs로 분류 할 수 있습니다. 이 연구는 BD Rhapsody™ Human Immune Response Panel 및 BD^® AbSeq Antibodies를 사용하여 Treg subset를 추가적으로 분석하고 putative cell differentiation trajectories을 확인했습니다. stimulatory/inhibitory receptors, cytokine/chemokine receptors 및 399 개의 mRNA 전사체를 포함하는 22 개의 단백질을 single-cell 수준에서 분석했습니다.

실험 설계

건강한 기증자의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 세포 분류를 위한 fluorochrome-conjugated 항체와 downstream sequencing-based protein 측정을 위한 BD^® AbSeq 항체와 함께 염색되었습니다. 샘플은 CD4 + CD25 + CD127 low / -Treg에 대해 분류했고 5,000 개의 분류된 Treg가  single-cell capture를 위해 BD Rhapsody ™ Single-Cell Analysis System 에 로딩되었습니다. 샘플 retrieval 후 sequencing을 위해 BD^® AbSeq 및 mRNA (BD Rhapsody ™ Human Immune Response Panel) library를 준비했습니다. Sequencing 결과는 BD Rhapsody™ Analysis Pipeline 및 SeqGeq™ Software

BD^® AbSeq 항체를 사용한 Tregs cell의 표현형 특성 분석

이 연구에서는 BD^® AbSeq 항체가 이전에 다른 기술을 사용하여 정의된 주요 Treg subset을 명확하게 식별하는 능력을 먼저 평가했습니다. 결과는 BD^® AbSeq 항체로CD45RA 및 HLA-DR과 같은 연속적으로 발현되는 항원의 명확한 분리가 가능하다는 것이었습니다. 선택된 marker의 발현은 CD45RA + HLA-DR- naïve cell, CD45RA-HLA-DR + 활성화 세포 및 CD45RA-HLA-DR- 세포 내에서 측정되었습니다. CD31은 최근 thymic emigrants (RTE)를 나타내는 CD45RA + HLA-DR- naïve Tregs의 작은 subset에서만 측정되었습니다. 반면에, CD95는 활성화된 Tregs 내에서 CD95 +apoptosis에 민감한 세포를 확인한 이전 보고서와 일치하는 CD45RA-HLA-DR- 및 CD45RA-HLA-DR + 활성화된 집단 모두에서 발현되었습니다. Chemokine receptor CD185 (CXCR5)와 억제 수용체 CD279 (PD-1)에서도 뚜렷한 발현 패턴이 관찰되었습니다.

Monocle 분석에 의한 Treg 분화 특성 분석

Unsupervised high-dimensional 데이터 분석은 Treg subset의 식별을 개선하는 데 사용되었습니다. single-cell trajectory analysis와 differentiation process 의 transitional states 를 확인하기 위해 Monocle algorithm이 사용되었습니다. 22 개의 단백질과 399 개의 mRNA 표적의 발현에 기초하여, 8 가지 상태가 확인되었으며, 이는 Tregs의 뚜렷한 분화 상태를 나타내는 것으로 보입니다. 아래 그림 (B)의 single-cell heat map은 8 가지 상태에서 차별적으로 발현된 단백질과 유전자를 표시합니다. CD45RA의 점진적 손실 및 HLA-DR의 upregulation을 기반으로 각 상태에 속하는 세포를 왼쪽에서 오른쪽으로 정렬하여 naïve 세포에서 활성화된 세포로의 진행을 나타냅니다. CD45RA 발현의 차등 수준 외에도 CD31이 RTE의 signature과 일치하는 상태 7 세포에서만 독점적으로 발현되기 때문에 이 세 가지 상태를 더욱 확실히 구별할 수 있습니다. 다른 한편으로, 상태 5에서 CD95의 배타적 발현과 CD45RA의 concurrent downregulation은 naïve 세포에서 apoptosis에 민감하고 활성화된 세포로의 전환을 시사하는 것일 수도 있습니다.

실험 개요

HetaSep ™ (STEMCELL Technologies)를 사용하여 말초 혈액 백혈구를 분리하고 세포 분류를 위해 12 개의 형광색소 결합 항체 panel로 표지했습니다. 세포는 또한 차세대 sequencing을 통한 다운 스트림 단백질 측정을 위해 42 개의 올리고 뉴클레오티드-접합 BD^® AbSeq 항체로 동시에 염색되었습니다. CD19, CD14, TCRγδ, TCRαβ, CD123, CD1a, BDCA2 및 FCεR1α 항체의 BD Horizon Brilliant Violet ™ 510 (BV510) Dye-labeled cocktail을 "덤프 채널"로 사용하여 혈통 세포를 제외했습니다. T cell및 NK cell의 명확한 분리 및 배제를 보장하기 위해 CD3 및 CD56 항체가  분류 panel에 추가되었습니다. 총 ILC는 Lineage-CD45 + CD127 + 세포로 정의되었으며 BD FACSAria ™ 융합 세포 분류기를 사용하여 분류하고 single-cell capture를 위해 BD Rhapsody ™ Single-Cell Analysis System 에 로드했습니다. 샘플 retrieval 후 라이브러리를 sequencing을 위해 single-cell BD^® AbSeq 및 mRNA (BD Rhapsody ™ Human Immune Response Panel)를 준비했습니다. BD Rhapsody™ Analysis Pipeline 및 SeqGeq™ Software 를 사용하여 데이터를 분석했습니다. 그런 다음 single-cell 분석을 사용하여 발견된 생물학적 정보를 활용하여 high-parameter 유세포 분석 panel design을 guide 했습니다. Multiomic 분석에서 얻은 정보는 BD FACSymphony ™ A5 Cell Analyzer 의 21-color 유세포 분석 panel을 사용하여 4 명의 건강한 기증자의 말초 혈액 ILC를 분석하는 방법으로 검증했습니다.

Multiomic 분석에 의해 밝혀진 주요 ILC subgroup의 차이

처음에는 CD117- CD294- ILC1, CD117 +/- CD294 + ILC2 및 CD117 + CD294- ILC progenitors / ILC3 (ILCP / ILC3)로 정의된 순환 ILC의 세 가지 주요 그룹을 수동으로 gating하여 데이터 분석을 수행했습니다. Single-cell AbSeq 및 mRNA 데이터를 사용하여 3 개의 ILC 그룹 간에 차등 발현 분석을 수행하고 각 그룹에 대한 고유한 단백질 및 mRNA  signature를 확인했습니다. 이 분석에서는 ILC 그룹을 정의하는 주요 전사 인자에 대한 예상 발현 패턴이 나타났습니다. 예를 들어, T-bet (TBX21)을 암호화하는 유전자는 ILC1 세포의 subset에서만 독점적으로 발현된 반면 GATA3는 ILC2 세포에서 최고 수준으로 발현되었습니다. 최근 보고된 바와 같이, RORγδ를 암호화하는 RORC는 ILC3 표현형 (CD117 + CD294-ILCP / ILC 3 세포)을 나타내는 circulating ILC 전구 세포에 의해 부분적으로 발현되었습니다.

ILC1 집단의 이질성에 대한 통찰력

Single-cell 히트맵은 대표 marker 대부분이 모든 세포에 의해 균일하게 발현되지 않았기 때문에 각 ILC 그룹 내에서 이질성을 나타냈습니다. 따라서 이러한 데이터는 ILC의 각 그룹 내에 추가 subset이 존재함을 시사합니다. 예를 들어, CD4는 대부분  ILC1 세포에서 독점적으로 발현되었지만, 모든 ILC1세포에서 발현된 것은 아니었습니다. 이러한 관찰 내용은 이전 보고서와 일치하며,   ILC1 내의 CD4 + 및 CD8 + 세포의 개별 subset을 보여주는 bi-variate plot analysis의 결과를 추가로 확인해주는 내용입니다. 그러나 ILCP / ILC3 세포의 경우는 이러한 subset이 나타나지 않았습니다.

실험 개요

서로 다른 식이요법을 한 mouse의 multiple 조직에서 얻은 20,000개의 single-cell 연구에서 30개의 단백질과 399 개의 표적화된 mRNA를 분석했습니다. 세포 분화 및 활성화 marker 분석을 통해 수많은 세포 구획과 HFD와 관련하여 관찰된 뚜렷한 변화를 살펴보았습니다. HFD 및 control diet 마우스는 Jackson Laboratories에서 입수했습니다. 7 주령 마우스를 17 주 동안 control diet 또는 HFD로 관리했습니다. 골수, 흉선, 비장 및 부고환 지방 조직으로부터 single-cell 현탁액을 준비했습니다. 조직 수집 및 해리 후, 그림에 표시된 8 개의 샘플을 BD^® Mouse Immune Single-Cell Multiplexing Kit 및 30 개의 BD^® AbSeq BD^® AbSeq Mouse Antibodies에서 고유한 DNA 바코드 항체 12 개 중 하나로 염색했습니다. BD Pharmingen ™ FITC Rat Anti-Mouse CD45 항체는 지방 조직 세포의 염색에 포함되었고 CD45 + 세포는 BD FACSAria ™ Fusion Cell Sorter에서 분류되었습니다. 8 개의 샘플을 모아 BD Rhapsody ™ Single-Cell Analysis System에 로드했습니다. 샘플 retrieval후, sequencing을 위해 BD^® AbSeq, 샘플 태그 및 mRNA (BD Rhapsody ™ Mouse Immune Response Panel) 라이브러리를 준비했습니다. sequencing 결과는 BD Rhapsody™ Analysis Pipeline 및 SeqGeq ™ Software 로 분석했습니다.

A. 실험 개요 및 BD Rhapsody ™ 시스템 워크 플로우. B.이 연구에 사용 된 BD^® AbSeq Antibodies 목록.

편향되지 않은 세포 cluster링은 여러 샘플에서 여러 세포 표현형을 식별합니다.

t-SNE는 데이터 관찰을 위해 위의 실험에서 생성된  multiomic data와 세포 집단 측정을 위해 unbiased clustering algorithm PhenoGraph, SeqGeq™ Software plug-in 을 이용하여 생성했습니다. PhenoGraph는 네 가지 다른 조직 유형에 걸쳐 12 개의 세포 cluster를 식별했습니다. 12 개의 cluster 중 4 개는 control cluster 1, 5, 7 및 12와 비교하여 HFD 마우스의 지방 조직에서 세포 밀도 및 분포의 차이를 보여주었습니다.

대조군 및 HFD 마우스의 지방 조직에서 CD8 + T 세포의 단일 세포 단백질 및 표적 mRNA-Seq 분석

cluster 12의 특성분석을 통해 세포 표면에서 CD8b이 높게 발현되었고, 이는 cluster가 주로 CD8 + T cell로 구성되었음을 시사합니다. 특히, HFD 마우스의 cluster 12는 control보다 CD8 + T cell 농도가 높게 나타났습니다. 이 cluster의 차별적 mRNA 및 단백질 발현 분석은 피로를 겪고 있는 세포의 추정 marker인 Pdcd1 (CD279, PD-1 mRNA), Lag3 및 Tigit의 발현이 증가되었음을 보여주었습니다 (하단 패널 B).

HFD 지방 조직에서 CD8 + T cell의 Monocle 분석은 이러한 세포가 세포 고갈을 겪었음을 시사합니다.

Monocle을 사용한 지방 조직의 CD8 + T cell 특정 분석은 5 가지 발달 상태를 구별했습니다. Control 마우스의 CD8 + T cell은 상태 1 및 2에 속한 반면 HFD 마우스의 세포는 상태 3, 4 및 5로 이동했습니다. HFD 마우스의 상태 2, 3, 4 및 5는 Tigit뿐만 아니라 CD279 (PD-1) 단백질 및 mRNA (Pdcd1)와  같은 marker에서도 exhaustion 발현이 증가했습니다.