AbSeq Immune Discovery Panel

단일 실험에서 최대 30개의 immune marker 측정

BD^®AbSeq Immune Discovery Panel (IDP)은 항체 올리고 기반 기술을 사용하여 개발되었으며, single tube에서 동결 건조된 대부분의 주요 human immune markers 대한 30 가지 specificity로 구성됩니다. BD^® AbSeq IDP는 human immune marker를 측정하기 위해 테스트 되었고, BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System 에서 BD Rhapsody™ Single-Cell RNA Assays 및 BD^® Multiplexing Kits와 함께 사용하도록 설계되었습니다.

BD® AbSeq Immune Discovery Panel brochure 에서 상세한 내용을 확인해보세요.

BD^® AbSeq IDP Specificities 목록

30 pre-titrated antibodies


Specificity	Clone	Oligo ID
CD3	UCHT1	AHS0231
CD4	SK3	AHS0032
CD8	SK1	AHS0228
CD11c	B-Ly6	AHS0056
CD14	MPHIP9	AHS0037
CD16	3G8	AHS0053
CD19	SJ25C1	AHS0030
CD25	2A3	AHS0026
CD27	M-T271	AHS0025
CD28	L293	AHS0138


Specificity	Clone	Oligo ID
CD45RA	HI100	AHS0009
CD56	NCAM16	AHS0019
CD62L	DREG-56	AHS0049
CD127	HIL-7R-M21	AHS0028
CD134	ACT35	AHS0013
CD137	4B4-1	AHS0003
CD161	HP-3G10	AHS0205
CD183 (CXCR3)	1C6/CXCR3	AHS0031
CD185 (CXCR5)	RF8B2	AHS0039
CD186 (CXCR6)	13B 1E5	AHS0148


Specificity	Clone	Oligo ID
CD196 (CCR6)	11A9	AHS0034
CD197 (CCR7)	2-L1-A	AHS0273
CD272	J168-540	AHS0052
CD278	DX29	AHS0012
CD279	EH12.1	AHS0014
CD357 (GITR)	V27-580	AHS0104
CD366 (TIM-3)	7D3	AHS0016
HLA-DR	G46-6	AHS0035
IgD	IA6-2	AHS0058
IdM	G20-127	AHS0198

BD^®AbSeq IDP 프로토콜

BD^® AbSeq IDP 사용을 위해서는 다음 단계를 준수해주십시오.

동결건조된 IDP를 재구성하고 cell을 염색하는 단계

포일 백에서 IDP를 꺼내 5분 동안 실온에 둡니다.
Pellet이 튜브 바닥에 있는지 확인하십시오.
뉴클라아제가 없는 물 35ul를 튜브의 바닥으로 넣어, 5분 동안 실온에서 항체가 재구성되도록 합니다.
Cell이 염색할 준비가 될 때까지, 재구성한 항체는 얼음에 보관합니다.
주의: 재구성된 항체는 24시간 이내에 사용해야 합니다.
2X AbSeq labeling master mix를 만들기 위해 BD Pharmingen™ Stain Buffer 65 µL를 용액에 추가하여 총100 µL이 되도록 합니다
BD® AbSeq Ab-Oligos (Doc ID 214394 Rev. 1.0)로 Single Cell Labeling 후 준비된 cell suspension 100 µL와 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 cell을 염색합니다.
Labeled cell에 BD PharmingenTM Stain Buffer (FBS) 3mL를 넣고 피펫팅하여 섞어줍니다.
400 x g 에서 각 튜브를 5분 동안 원심분리 합니다.
각 튜브의 뚜껑을 열고 상청액을 감염성 폐기물에 붓습니다. 튜브를 거꾸로 한 다음 튜브 가장자리에서 잔류 상청액을 제거하기 위해 보푸라기가 없는 수건으로 가볍게 닦아냅니다.
7~9번 단계를 두번 더 반복하여 총 3회 세척합니다.
BD Rhapsody™ Cartridge Reagent Kit의 620 µL cold BD Pharmingen™ Stain Buffer (FBS)에서 pellet을 resuspend하고, single-cell capture를 진행합니다.

BD Rhapsody™ Systems (Doc ID: 220524)을 이용한 Single Cell Analysis Workflow를 참조하십시오.

성능

BD^® AbSeq IDP의 성능은 single vial BD^® AbSeq Reagents의 동일한 30가지 specificity 의 fresh mixture를 사용하여 생성된 데이터와 유사합니다.

IDP와 새로 혼합된 BD® AbSeq Antibodies의 성능이 유사하게 나타났습니다. 전혈에서 분리한 후, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 휴지기(미처리) 및 활성화(CD3/CD28로 24 시간 동안 처리) 그룹으로 나누었습니다. 휴지 및 활성화 세포를 1:1로 혼합한 것을 IDP 또는 동일한 AbSeq specificity를 가진 새로 혼합한 mixture로 염색했습니다. 그런 다음 동일한 수의 세포를 BD Rhapsody ™ Cartridges에 로드하고 AbSeq 및 WTA 라이브러리를 생성하고 시퀀싱했습니다(이 연구에서 n = 개별실험 2건). SeqGeq™ Software 및 Dataview Software 를 사용하여 데이터를 분석했습니다. A. UMAP는 IDP와 fresh BD® AbSeq Antibody-stained sample간에 확인된 세포 그룹이 상당히 중복된다는 것을 보여주었습니다. B. IDP 및 fresh BD® AbSeq Antibody mixture 로 측정된AbSeq 분자의 총 수는 0.98보다 커 R2와의 높은 상관관계를 보여주었습니다.

A. UMAP는 IDP와 fresh BD^® AbSeq Antibody-stained sample간에 확인된 세포 그룹이 상당히 중복된다는 것을 보여주었습니다.

B. IDP 및 fresh BD^® AbSeq Antibody mixture 로 측정된AbSeq 분자의 총 수는 0.98보다 커 R2와의 높은 상관관계를 보여주었습니다.

BD^® AbSeq IDP에 포함된 모든 30가지 specificity는 다수 donor의 PBMCs에 대해 테스트할 때 개별 표적을 신뢰성 있게 측정합니다.

IDP에 포함 된 30 개의 AbSeq specificities의 성능. 위 그림에서 설명된 바와 같이 PBMCs를 activated 및 준비했습니다. 염색 후, BD Rhapsody ™ System에서 cell을 capture하고AbSeq 및 WTA 라이브러리를 생성하고 시퀀싱했습니다. 80 % 이상의 sequencing saturation을 얻기 위해 Illumina™ NextSeq™ High-Output Kit를 사용하여 WTA의 경우 20,000 reads/cell, AbSeq의 경우 30,000 reads/cell로 라이브러리를 시퀀싱했습니다. SeqGeq™ Software 및 Dataview Software를 사용하여 데이터를 분석했습니다. 최소 두 명의 donor에 대해 위의 실험을 반복했습니다. 한 donor에서 얻은 대표적인 수치들을 나타낸 그림입니다

A. IDP 항체 및 WTA mRNA 프로파일에 의해 resolve된 휴지 + 활성화된 PBMCs의 UMAP cell annotation.

B. Individual cell 유형에 대한 AbSeq 측정 specificity 를 보여주는 (A)의 UMAP에 있는 IDP의 각 AbSeq 클론의 heatmap.

BD^® AbSeq IDP 또는 추가한 항체의 specificity를 손상시키지 않고 IDP에 더 많은 BD^® AbSeq Antibodies를 추가합니다.

IDP는 유연한 backbone panel이며 추가 AbSeq specificity를 수용합니다. 3 개의 BD^® AbSeq Antibodies 를 첨가하고 재구성된 IDP pellet (n = 2)과 혼합했습니다.

A. IDP 성능은 높은 상관 관계 (drop-in 유무에 관계없이 0.99 이상의 R2)에서 알 수 있듯이, drop-in의 영향을 받지 않았습니다.

B. CD8 [SK1] 및 CD45RA (맨 위 줄)의 IDP specificity는 drop-in CD8 [RPA-T8], CD45RO 및 CD38 (맨 아래 줄) specificity에 대해 평가되었으며 UMAP에 나타납니다. CD38에 대한drop-in은 CD38에 양성일 것으로 예상되는 세포 유형을 측정했습니다. CD8 용 drop-in-clone(RPA-T8)은 IDP 클론 (SK1)과 매우 유사한 염색 패턴을 보였으며 이는 drop-in 항체의 높은 specificity와 동일한 항원에 대한 두 클론의 호환성을 시사합니다. CD45RA (IDP)와 비교했을 때 CD45RO (drop-in)의 대조적인 발현 패턴은 AbSeq specificity를 IDP에 추가하는 것이 실험 결과에 부정적인 영향을 미치지 않음을 확인해주는 것입니다.

BD^® AbSeq IDP는BD Rhapsody™ RNA Assays 및BD^® Multiplexing Kits와 seamless하게 작동합니다.

IDP는 RNA 및 multiplexing assays와 함께 사용하도록 설계되었습니다.

A. IDP-stained cells (휴지 및 활성화된 PBMC의 1:1 혼합물)의 WTA와 AbSeq 라이브러리를 생성 및 시퀀싱 했습니다. Multiomic 분석의 힘을 설명하기 위해 WTA 데이터(mRNA 분석)만 분석하여 WTA + AbSeq 데이터(mRNA and protein 분석)와 비교했습니다. 왼편에 WTA (mRNA) 데이터만을 이용한UMAP 좌표와 unbiased clustering (Phenograph)이 표시되었으며 WTA + AbSeq (mRNA and protein) 데이터를 이용한 좌표 및 annotation을 오른쪽에 표시했습니다. Multiomics 접근법을 통해 더 깊은 생물학적 통찰력을 제공하는 cell 유형이 추가로 밝혀졌습니다.

B. BD® Single-Cell Multiplexing Kit (SMK) 및 IDP와의 호환성 테스트를 위해, SMK 및 IDP를 함께 사용하여 cell 염색을 수행했으며 WTA, AbSeq 및 SMK 라이브러리를 생성하여 시퀀싱을 했습니다. 그리고 IDP에서 marker의 발현을 SMK없이 생성된 데이터와 비교했습니다. 이 데이터를 통해 IDP + WTA 와 IDP + WTA + SMK의 경우를 비교하여 높은 상관관계(R2 >0.99)가 있고 SMK 추가가 IDP에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었습니다.