蛍光イメージング技術は、細胞や組織を構造や機能の側面から検討する場合に極めて有用です。免疫組織化学技術と蛍光イメージング技術を組み合わせることで解析能力が格段に増強され、より広範な研究分野への利用や臨床応用が促進されます。蛍光顕微鏡は、生細胞において全オルガネラの可視化を可能にしたことで、細胞生物学分野に革命をもたらしました。免疫組織化学および免疫細胞化学では通常の蛍光イメージング技術に抗原-抗体結合能を組み合わせ、蛍光顕微鏡を使用して細胞や組織の解析を行います。
免疫蛍光技術とその応用
免疫蛍光（IF）は強力な免疫染色技術であり、蛍光コンジュゲート抗体を用いて研究対象のタンパク質や様々な分子を標識し、蛍光顕微鏡によって標識されたターゲットを可視化します。IFにより細胞や組織の特定抗原を検出することができ、目的タンパク質の有無、局在、および活性化状態が可視化されます。さらに、IFは免疫反応の解析にも有用です。
免疫蛍光の原理と種類
IFは、蛍光分子や蛍光色素が特定波長の光子を吸収（分子特有の吸収スペクトル）して励起状態になり、その後すぐに余剰エネルギーを光子として放出（発光スペクトル）する、という特性を利用しています。放出される光子は低エネルギーのため、発光スペクトルは吸収スペクトルより長波長側にシフトします。蛍光色素は可視光や紫外線によって励起され、蛍光発光は蛍光顕微鏡によって可視化されます。
高い光安定性と蛍光量子収率を有し、励起最大値が400～＜700 nmの範囲内にある蛍光色素が市販されています。これらの蛍光色素は細胞を損傷することはなく、生細胞の標識には問題ありません。
免疫蛍光では、最初に細胞や組織を固定してから透過処理を行います。試料の免疫染色には、目的抗原を認識する蛍光色素コンジュゲート抗体を用います。その後、染色試料は蛍光顕微鏡によるイメージングで可視化されます。IFは、使用する抗体およびシグナル増強の有無によって直接法と間接法の2種類に大別されます。
直接免疫蛍光法
目的タンパク質の免疫染色および検出のために、使用する抗体は1種類（1次抗体）です。蛍光コンジュゲート1次抗体を目的タンパク質に直接結合させ、蛍光顕微鏡を使用して可視化します。
直接IF法の利点：
- 産生動物種を考慮して抗体を選択する必要がなく動物種間の交叉反応を低減
- 間接IF法より試料調製の工程数が少なく実験時間の節約が可能
直接IF法の弱点
- 2次抗体を用いたシグナル増強が不可
- 充分な検出感度が得られない可能性
- 蛍光コンジュゲート1次抗体の種類が限定的
- 蛍光コンジュゲート2次抗体を用いた検出法より高価
間接免疫蛍光法
目的タンパク質の免疫染色および検出のために、2種類の抗体（1次抗体と2次抗体）を使用します。最初に1次抗体を目的タンパク質に結合させ、次に、抗原-1次抗体複合体を識別するために蛍光コンジュゲート2次抗体（1次抗体と異なる動物種反応性）を1次抗体に結合させます。この際、複数の2次抗体を1次抗体に結合させて蛍光シグナルを増強することが可能なため、検出感度を向上させることができます。
間接IF法の利点：
- 1次抗体に複数の2次抗体が結合することでシグナル増強が可能
- シグナル増強されることで直接IF法より高感度
- 蛍光コンジュゲート2次抗体の種類が豊富
- 蛍光コンジュゲート1次抗体を用いた検出法より安価で経済的
間接IF法の弱点：
- 動物反応性が異なる2種類の抗体を必要とするため、動物種による交叉反応リスクが上昇
- 直接IF法より反応数が多いことにより実験時間が延長
免疫蛍光顕微鏡の種類と用途
直接免疫蛍光法および間接免疫蛍光法では、いずれも蛍光シグナルを可視化するために蛍光顕微鏡を使用します。試料のイメージングには、実験の目的や解析内容によって落射蛍光顕微鏡または共焦点蛍光顕微鏡のいずれか適した方を使用します。
落射蛍光顕微鏡（広視野顕微鏡）
細胞の形態や、目的とする細胞性タンパク質やマーカー分子の存在および局在を視覚化し、さらに細胞表現型解析が可能です。
共焦点顕微鏡
試料を高解像度で3次元解析する必要がある場合に使用します。細胞内タンパク質の局在や共局在解析、およびタンパク質間相互作用の解析に使用します。
Typical fluorescence microscopy channels
免疫細胞化学、免疫組織化学、免疫蛍光 － 各技術の違い
免疫細胞化学（ICC）と免疫組織化学（IHC）においては、いずれも目的抗原を標識するために抗原抗体反応を利用します。その際に用いる試料標識技術が免疫蛍光です。ICCとIHCは、区別せずに使用されることがあります。
しかし、ICCは細胞内解析を主体としており、一方IHCは組織全体を検討するための実験技術です。目的タンパク質の検出にはいずれも蛍光免疫法が用いられますが、酵素法（3,3’-diaminobenzidine[DAB]など）による検出も可能です。
免疫蛍光法による検出が酵素法より優れた点
- 蛍光シグナルの定量解析が可能（酵素法の場合は定性解析）
- マルチプレックス化（異なる発光スペクトルを有する蛍光色素を使用することで複数の目的タンパク質の同時検出）が可能
- 光安定性に優れた蛍光色素を使用可能
Photostability of BV dyes
Right image: Continuous exposure to excitation light. Cells: MCF7 cells. Fixation: BD Cytofix™ Fixation Buffer (Cat. No. 554655). Antibodies: Purified Mouse Anti-Human CD324 (Cat No. 562869) with BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) Goat Anti-Mouse (Cat. No.564877), BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) Goat-Anti-Mouse (Cat. No. 563846), or Alexa Fluor™ 488 Goat Anti-Mouse (Thermo Fisher Scientific). Other reagents: ProLong™ Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Instrument: ImageXpress™ Micro XLS System (Molecular Devices). 20X objective.
免疫蛍光イメージングにおけるBDバイオサイエンスの製品ポートフォリオ
BDバイオサイエンスでは、ICC/IHCによる研究を包括的にサポートしており、蛍光イメージング試験に有用なモノクローナル抗体、蛍光色素、2次抗体試薬、およびバッファーなど、高品質の製品を揃えています。また、技術的サポートとして、組織切片試料の調製法や染色法を含む免疫蛍光技術による実験プロトコールも用意しています。
免疫蛍光イメージング試験のプロトコールと関連資料
以下は、ICC/IHC試験において有用な、試料調製法および免疫蛍光法による実験プロトコールです。
- Immunofluorescence Protocol for BD Pathway Certified Reagents
- Preparation and Staining of Frozen Tissue Sections
BDバイオサイエンスのイメージング用蛍光色素は、Sirigen社のポリマー色素技術を応用し、イメージングにおける弊社の経験と専門性を基盤として開発されました。輝度が極めて強いため、感度を向上することができます。また、特異なスペクトルを有することでマルチプレックス化も用意です。
詳細はこちらBD Horizon Brilliant Violet™ Imaging Reagentをご覧下さい。
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落射蛍光顕微鏡を使用してDAPI染色した試料を解析する際の推奨フィルター構成
Channel Dyes Excitation (nm) DC (nm) Emission (nm) Optimized Filter Sets Blue DAPI 377/50 409 430/24 or 440/40 Chroma or Semrock Aqua BD Horizon Brilliant
Violet™ 480 (BV480)445/20 or 438/24 458 483/32 Chroma or Semrock Green FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30 or 485/20 506 or 495 537/26 or 525/50 Chroma or Semrock Orange Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor Red Alexa Fluor® 594 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor Far Red Alexa Fluor® 647 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor 免疫蛍光によるイメージングの質を改善するために、BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480)を使用する場合に推奨されるフィルター構成。
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落射蛍光顕微鏡を使用し、DAPI以外の蛍光色素により核対比染色した生細胞試料を解析する際の推奨フィルター構成
高輝度の蛍光色素を1種類使用する場合のフィルター構成：免疫蛍光によるイメージングの質を改善するために、BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421)を使用する場合
Channel Dyes Excitation (nm) DC (nm) Emission (nm) Optimized Filter Sets Blue BD Horizon Brilliant
Violet™ 421 (BV421)392/23 or 377/50 409 430/24 or 447/60 Chroma or Semrock Aqua BD Horizon Brilliant
Violet™ 480 (BV480)438/24 or 445/20 458 483/32 Chroma or Semrock Green FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30 or 485/20 506 or 495 537/26 or 525/50 Chroma or Semrock Orange Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor Red Alexa Fluor® 594 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor Far Red Alexa Fluor® 647, DRAQ5™ (DNA) Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor 免疫蛍光によるイメージングの質を改善するために、BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421)を使用する場合に推奨されるフィルター構成。
高輝度の蛍光色素を2種類使用する場合のフィルター構成：免疫蛍光によるイメージングの質を改善するために、BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421)とBV480を使用する場合
Channel Dyes Excitation (nm) DC (nm) Emission (nm) Optimized Filter Sets Blue BD Horizon Brilliant
Violet™ 421 (BV421)392/23 or 377/50 409 430/24 or 440/40 Chroma or Semrock Aqua BD Horizon Brilliant
Violet™ 480 (BV480)438/24 or 445/20 458 483/32 Chroma or Semrock Green FITC, Alexa Fluor® 488, eGFP, zsGreen 490/30 or 485/20 506 or 495 537/26 or 525/50 Chroma or Semrock Orange Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 568 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor Red Alexa Fluor® 594 Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor Far Red Alexa Fluor® 647, DRAQ5™ (DNA) Any optimized filter set Any optimized filter set Any optimized filter set Any vendor -
落射蛍光顕微鏡を使用する場合の推奨フィルター構成
Up to 5-Color Configuration Laser Line Dyes DAPI Essential 405 nm DAPI 440 nm or 458 nm BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) 488 nm Alexa Fluor® 488 or GFP 561 nm Alexa Fluor® 568 or RFP 633 nm Alexa Fluor® 647 Alternate DNA Stain 405 nm BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) and
BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480)440 nm or 458 nm Laser line not essential 488 nm Alexa Fluor® 488 or GFP 561 nm Alexa Fluor® 568 or RFP 633 nm DRAQ5™ or Alexa Fluor™ 647
BDバイオサイエンスの抗体および試薬を用いた実験例
Spleen cryosections (5 µm) from mice expressing CX3CR1-green fluorescent protein (pseudo-colored green) and CCR2-red fluorescent protein (pseudo-colored red) were fixed with BD Cytofix™ Fixation Buffer (Cat. No. 554655), blocked with 5% goat serum and 1% BSA diluted in 1X PBS, and stained with BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) Rat Anti-Mouse CD4 (Cat. No. 562891) (pseudo-colored magenta), Alexa Fluor® 647 Rat Anti-Mouse CD45R/B220 (Cat No. 557683) (pseudo-colored yellow), and BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex (pseudo-colored cyan). Slides were mounted with ProLong® Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) and the image was captured on a BD Pathway 435 Cell Analyzer (epifluorescence microscope) and merged using BD Attovision Software. 20X objective. Carried out in collaboration with the Catherine Hedrick lab at La Jolla Institute of Allergy and Immunology.
MCF-7 cells (ATCC, HTB-22) were fixed with BD Cytofix™ Fixation Buffer (Cat. No. 554655), permeabilized with 0.1% Triton™ X-100 and blocked with 5% goat serum, 1% BSA, 0.5% Triton™ X-100 in 1X PBS. Cells were incubated with Purified Mouse Anti-E-Cadherin (Cat. No. 610182) and the second-step reagent was BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) Goat Anti-Mouse (Cat. No. 564877) (pseudo-colored aqua). Cells were then stained with directly conjugated antibodies: Alexa Fluor™ 488 Mouse Anti-β-Tubulin (Cat No. 558605) (pseudo-colored green), Alexa Fluor™ 555 Mouse Anti-Human Ki-67 (Cat. No. 558617) (pseudo-colored purple), Alexa Fluor™ 647 Mouse Anti-GM130 (Cat. No. 558712) (pseudo-colored red). DAPI (Cat. No. 564907) was used as a nuclear counterstain (pseudo-colored blue). Slides were mounted with ProLong™ Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) and the image was captured on a BD Pathway 435 Cell Analyzer and merged using BD Attovision Software (BD Biosciences). 20X objective
Cultured cells from the H9 human ES cell line were fixed with BD Cytofix™ Fixation Buffer (Cat. No. 554655), permeabilized with 0.1% Triton™ X-100 diluted in 1X PBS, blocked with 5% goat serum, 1% BSA, and 0.5% Triton™ X-100 diluted in 1X PBS, and stained with BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) Mouse Anti-SSEA-1 (Cat. No. 562705), BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) Mouse Anti-CD324(E-Cadherin) (Cat. No. 565646), Alexa Fluor™ 488 Mouse Anti-Oct3/4 (Cat. No. 561628), and Alexa Fluor™ 555 Mouse Anti-Human Ki-67 (Cat No. 558617). DRAQ5™ (Cat. No. 564902) was used as a nuclear counterstain. Slides were mounted with ProLong™ Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) and the images were captured on a BD Pathway 435 Cell Analyzer (epifluorescence microscope) and merged using BD Attovision Software. 20X objective.
Cells: H9 human embryonic stem cells (WiCell, Madison WI). Fix: BD Cytofix™ Fixation Buffer (Cat. No. 554655); Perm: BD Phosflow™ Perm Buffer III (Cat. No. 558050), Block/Stain: 5% goat serum, 1% BSA, 0.5 % Triton™ X-100 in 1X PBS. Antibodies: Purified Mouse Anti-Oct3/4a (Cat. No. 561555) with BD Horizon Brilliant Violet™ 480 (BV480) Goat Anti-Mouse (Cat. No. 564877), BD Horizon Brilliant Violet™ 421 (BV421) Mouse Anti-Human TRA-1-60 Antigen (Cat. No. 562711). Other reagents: DRAQ5™ (BioStatus), ProLong™ Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Instrument: BD Pathway 435 Cell Analyzer and images merged using BD Attovision Software (BD Biosciences). 20X objective.
BDバイオサイエンスの免疫蛍光試薬を用いた応用実験
BDバイオサイエンスの免疫蛍光試薬を用いたイメージングの様々な応用試験については、以下をご覧下さい。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.
Alexa Fluor and ProLong are trademarks of Thermo Fisher Scientific. DRAQ5 is a trademark of BioStatus Limited. ImageXpress is a trademark of Molecular Devices. Triton is a trademark of Dow.
