幹細胞 | フローサイトメトリー

Overview

幹細胞は、自己複製能と様々な細胞に分化する能力を持ち、いくつかの治療用途で非常に重要です。この能力は、血液、皮膚、腸など、絶えず新しい細胞が作られ、ターンオーバーを繰り返す組織に不可欠です。幹細胞は、胚（胚性幹細胞）から成人期（成体幹細胞）までのすべての発達段階で見られます。いくつかの種類の幹細胞が発生過程で出現し、組織の恒常性に積極的に関与します。¹

幹細胞と幹細胞ニッチ

幹細胞は分化能力の違いによって、全能性、多能性、オリゴポテンシーおよび単分化能を含む、異なるタイプに分類されます。胚性幹細胞（ESC）や人工多能性幹細胞（iPSC）などの多能性幹細胞は、幹細胞研究で広く使用されています。 ESCは、培養において胚発生の3つの胚葉に分化することができます。成熟した細胞や体細胞は、造血幹細胞を含む分化能を持った多能性幹細胞から誘導されます²。

多能性間葉系幹細胞としても定義される間葉系幹細胞（MSC）は、骨や軟骨などの間葉系組織の前駆細胞です。そして、それらは、樹状細胞の抗原提示活性、ナチュラルキラー（NK）細胞の細胞毒性、B細胞による抗体産生などのいくつかの免疫機能を調節します。強力な免疫抑制機能のために、MSCは炎症性および自己免疫疾患における細胞治療において重要な役割を果たします。いくつかの研究は、MSCが無関係の組織の細胞タイプにも分化する能力を示唆しています³。MSCとその派生物は、周産期細胞、骨髄間質細胞、骨系列細胞など、HSCニッチを構成するいくつかのタイプの細胞を含みます。MSCは、いくつかの成人組織（骨髄、末梢血、脂肪組織）または胎児組織から分離でき、細胞療法の研究や再生医療に利用されています。⁴

幹細胞ニッチ

幹細胞ニッチは、幹細胞が再編成され、自己複製し、未分化状態を維持できる育成環境です。適切な細胞シグナル伝達により、幹細胞はニッチから必要な標的領域に動員されます。脳の脳室下および顆粒下ゾーン (SVZおよびSGZ)、毛包、腸陰窩、骨髄など、多くの幹細胞ニッチが人体全体で確認されています。^{5, 6, 7}

幹細胞研究のためのマルチカラーフローサイトメトリー

様々な細胞表面や細胞内マーカーを利用することで、幹細胞が多能性を維持しているかどうか解析することができます。これには、蛍光色素結合抗体を使用します。幹細胞は、3種の一次胚葉および分化組織に分化しますが、その発現パターンの変化は抗体を使用して観察することができます。また、細胞表面マーカーを利用して細胞分取することで、更なる培養実験を行うことができます。さらには、BD Lyoplate™ 細胞スクリーニングパネル BD Lyoplate™ 細胞表面スクリーニングパネルのように、網羅的な解析を行い、薬剤の影響を観察したり、細胞集団の発現系を絞り込んで行くことにも利用できます。

BD バイオサイエンスは、様々な条件下で検証した高品質抗体や緩衝液などの製品と、プロトコールやアプリケーションを統合し、幹細胞研究をサポートしています。幹細胞を特性評価し、解析し、ソーティングする研究者をサポートする高度な技術とワールドクラスのサービスの融合なのです。

References

Zakrzewski W, Dobrzyński M, Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):68. doi:10.1186/s13287-019-1165-5
Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126(4):663-676. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024
Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature Rev Immunol. 2008; 8(9):726-736. doi: 10.1038/nri2395
Vizoso FJ, Eiro N, Cid S, Schneider J, Perez-Fernandez R. Mesenchymal stem cell secretome: Toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine. Int J Mol Sci. 2017;18(9):1852. doi: 10.3390/ijms18091852
Boulais PE, Frenette PS. Making sense of hematopoietic stem cell niches. Blood. 2015;125(17):2621-2629. doi:10.1182/blood-2014-09-570192
Ferraro F, Celso CL, Scadden D. Adult stem cels and their niches. Adv Exp Med Biol. 2010;695:155-168. doi:10.1007/978-1-4419-7037-4_11
Cable J, Fuchs E, Weissman I, et al. Adult stem cells and regenerative medicine-a symposium report. Ann N Y Acad Sci. 2020;1462(1):27-36. doi:10.1111/nyas.14243

Surface Staining

表面抗原染色

BD Biosciencesは、表面タンパク質エピトープの発現を変えることなく幹細胞を調製するための効果的なソリューションを提供します。

サンプル調製

幹細胞は接着性である傾向があり、3次元構造にて成長できます。フローサイトメトリー解析では、シングルセルに細胞を調製するため、酵素（BD™ Accutase細胞剥離剤、あるいはトリプシンなど）を用いたりや機械的にスクラッピングして剥離します。酵素を用いた手法は、タンパクエピトープを切断したり修飾する場合があり、したがって、抗体の結合を妨げる可能性があるので、測定する表面マーカーについて評価しなくてはなりません。BD™ Accutaseは、トリプシンや機械的なスクラッピングよりマイルドな剥離ができるため、広範に応用できる傾向があります。

モノクローナル抗体

細胞を剥離し、洗浄したら、抗体で染色します。BD バイオサイエンスは、幹細胞研究に必要な、高品質で幅広い製品ラインを提供しています。様々な確立されたマーカーを始めとして、機能的に重要な新たなマーカーに対応します。特に、抗体試薬は、高付加価値ポリマー技術を応用した高輝度色素BD Horizon Brilliant™シリーズのラインアップが加わったことで、レアポピュレーションの解析や、弱陽性のポピュレーションの解析が簡単且つ、高い精度で得ることが可能になりました。また、使い易いReady to useの BD Stemflow™ キットやカクテル抗体もご用意しています。

幹細胞とその派生細胞の代表的表面マーカー

ヒトマーカー	マウスマーカー	BD Stemflow™ 及びその他のキット	Cat. No.
多能性幹細胞(ESCs 及び iPSCs)
Positive: Alkaline Phosphatase, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-81, TRA-1-60 Negative: SSEA-1	Positive: SSEA-1	ヒト iPSC ソーティング&解析キット	562626
ヒト多能性幹細胞ソーティング&解析キット	560461
ヒトおよびマウス多能性幹細胞解析キット	560477
造血幹細胞 (HSC)
Positive: CD34, CD49f, CD90 Negative: CD38, CD45RA, Lineage*	Positive: CD150, c-Kit, Sca1 Negative: CD34, CD41, CD48, Lineage	BD Pharmingen™ Human Lineage Cocktail 4	562722
マウス造血幹細胞分取キット	560492
間葉系幹細胞(MSC)
Positive: CD44, CD73, CD90, CD105, CD146, CD271 Negative: CD11b, CD19, CD31, CD34, CD45, CD144, HLA-DR	Positive: CD29, CD44, CD90, CD105, CD106, Sca-1 Negative: CD11b, CD31, CD45, Ter-119	ヒトMSC解析キット	562245
ヒト間葉系幹細胞系列カクテル抗体	562530
神経幹細胞(NSC)
Positive: CD15^mid, CD24, CD184 Negative: CD44, CD271
ニューロン
Positive: CD15^low, CD24 Negative: CD44, CD184	–	ヒト神経系細胞ソーティングキット	562271
Cancer
CD15, CD24, CD34, CD44, CD45, CD49f, CD166, CD326, CD338, Her-2/Neu, Lgr5	–	–	–

* Human lineage (lin) markers: CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD19, CD20, CD56, CD235a

造血幹細胞の表現型

造血系の細胞系列は、表面マーカー表現型が広く知られており、各細胞サブセットの分取も標準的な手法が確立されています。造血幹細胞（HSC）は、正常骨髄機能を補完できることから、現在幹細胞研究において注目を集めている領域です。

歴史的には、HSCは CD90 及び CD34¹ の発現が陰性である細胞系列として同定されてきました。今日では、自己再生能力のあるlong-term HSCs(LT-HSC)を濃縮するためにマーカーが追加されています。これらのマーカーには、CD38,² CD45RA,³、最近ではCD49f⁴があります。近年では、Lin –CD34 +CD38 –CD90 +CD45RA –CD49f + の表現型を示す細胞の約10% が長期にわたって自己再生する能力を維持していることがマウスモデルにて報告されています。⁴

References

Baum CM, Weissman IL, Tsukamoto AS, Buckle AM, Peault B. Isolation of a candidate human hematopoietic stem cell population. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(7):2804-2808. doi: 10.1073/pnas.89.7.2804
Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(10):5320- 5325. doi: 10.1073/pnas.94.10.5320
Majeti R, Park CY, Weissman IL. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 2007;1(6):635-645. doi: 10.1016/j.stem.2007.10.001
Notta F, Doulatov S, Laurenti E, Poeppl A, Jurisica I, Dick JE. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 2011;333(6039):218-221. doi: 10.1126/science.1201219

Intracellular Staining

細胞内染色

細胞内タンパクがどのような機能を担っているかを研究する上で、スピーディ且つ統計的に細胞内の事象を捉えるにはフローサイトメトリーは必須です。拡張することを可能にします。分化経路を考えるにあたって、重大な意味を持つ時点、マーカー、および細胞比率を同定するため、細胞表面染色と組み合わせて解析することができます。細胞内染色のプロトコールでは、細胞質および核へ抗体がアクセスするよう、細胞を固定および膜透過処理する必要があります。ただし、固定は事実上細胞を殺すので、細胞内染色を行うと生細胞ソーティングできません。

サンプル調製

細胞内染色でも、表面染色同様、酵素的または機械的方法によってシングルセルの細胞浮遊液を調製しなくてはなりません。BD Accutaseは、細胞凝集を防ぐのに役立ち、表面タンパクを維持することから推奨されます。細胞表面染色後、固定および膜透過処理し、細胞内抗原に対する蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメーターで解析します。

透過処理や染色条件を最適化するため、BDは数種類のキットを開発しました。キットには、様々な条件で検証した抗体および緩衝液、プロトコールなどが含まれています。

細胞の種類	細胞内マーカー	BD Stemflow™ キット	カタログ番号
Embryonic stem cells (ESCs) 人工多能性幹細胞(iPSC)	Nanog, Oct 3/4, Sox2	ヒト多能性幹細胞転写因子解析キット	560589
マウス多能性幹細胞転写因子解析キット	560585
神経幹細胞(NSC)	Nestin, Pax6, Sox1, Sox2	ヒト神経系解析キット	561526
アストロサイト	GFAP	ヒト神経系解析キット	561526
ニューロン	Doublecortin	ヒト神経系解析キット	561526
初期膵臓内胚葉	FoxA2, Pax6, Pdx1, Sox17	ヒト内胚葉分化解析キット	562496
後期膵臓内胚葉	NeuroD1, Nkx6.1
心臓細胞	cTNI, GATA4, Islet-1, Myosin Heavy Chain
肝細胞	AFP, GATA4

幹細胞の分化

ヒト多能性幹細胞が多様な細胞に分化する能力は、発生生物学における中心的なトピックであり、再生医療や細胞治療への応用が期待されています。多能性の細胞が異なる系統に分化するにつれて、転写因子やその他のタンパクの発現が変化します。多項目のタンパクを同時に解析できるフローサイトメトリーは、細胞集団の相対数を捉えることに非常に優れた方法であり、分化プロトコールや分化能を比較や定量する解析に有用です。

例えば、哺乳類の胚発生において、胚体内胚葉は、肝臓、膵臓、および腸を形成します¹。胚体内胚葉へ分化する間、転写因子Sox17およびFoxA2のレベルは上昇し、一方でNanog等の多能性マーカーは減少します²。

神経幹細胞の神経系への分化も、マルチカラーフロー解析で観察できます。神経幹細胞（NSC）がニューロンに分化するにつれ、Nestinの発現は徐々に低下し、初期のニューロンマーカーであるDoublecortinダブルコルチン（DCX）の発現が上昇します。Nestinを発現し続ける細胞集団は、CD44を発現するグリア細胞集団になって行きます。

迅速かつ効率的なプロファイリングへ

フローサイトメトリーを牽引してきたBD Biosciencesは、スクリーニングのためのソリューションも提供します。

幹細胞研究において直面する困難は、培養した細胞の分化の不均一さです。生細胞を、次の実験に使用するため、特定の細胞を分取するには、細胞表面の表現型を特定する必要があります

BD Lyoplate™ Screening Panels は、フローサイトメーターやバイオイメージングを用いて、数百種類細胞表面マーカーを、効率的にプロファイリングできる包括的なシステムです。プロテオームを網羅解析することで、様々な機能解析、薬剤スクリーニング、In vivoの動物実験、細胞治療などを目的とした実験系の戦略を明確にすることができます。

BD Lyoplate™ では、ヒトは242種類、マウスは176種類の細胞表面マーカーを測定できます。モノクローナル抗体を全て買い揃えなくても、実験可能なためコストを抑えることができます。

ヒト（カタログ番号560747）とマウス（カタログ番号562208）の両方のパネルに3つのプレートが含まれています。各ウェルには、1つの細胞表面マーカーまたはアイソタイプコントロールに対する凍結乾燥精製抗体が含まれています。　希釈後、細胞サンプルを精製抗体で染色し、その後、検出試薬を添加します。最後に、サンプルはフローサイトメトリーまたはイメージングで解析可能です。

抗体が予めプレートにセットされています。また自動処理装置やマルチピペッティングに最適なフォーマットです。さらには、ヒートマップ解析用のテンプレートもご用意しています。

BD Lyoplateパネルを用いたフローサイトメトリー及びイメージスクリーニングに関する考慮事項

サンプルの種類	フローサイトメトリー	イメージング
浮遊細胞	X
希少な細胞集団	X
サブポピュレーション解析複数マーカーで共染色	X
レポーターライン	X	X
形態学的変化		X
細胞数の制限		X

References

Murry CE, Keller G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.  2008;132(4):661-680. doi: 10.1016/j.cell.2008.02.008
D’Amour KA, Agulnick AD, Eliazer S, Kelly OG, Kroon E, Baetge EE. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nat Biotechnol. 2005;23(12):1534-1541. doi: 10.1038/nbt1163

Screening

神経系細胞のスクリーニング

多能性幹細胞由来の神経細胞集団は、ヒト疾患および発生の研究に重要です。多能性幹細胞は、自己再生するNSCsに分化させることができ、それはさらにニューロンとグリアのヘテロな集団に分化させることができます¹。更なる研究への鍵は、各々の細胞の表面マーカーの表現型を同定することです。

例では、BD Lyoplate™ ヒト細胞表面マーカースクリーニングパネル（カタログ番号560747）を用いて、NSCおよびニューロンの細胞表面表現型を同定しています。パネルAにおいて、神経系へ誘導をした培養細胞をフローサイトメトリーでスクリーニングし、NSCマーカーの候補をヒートマップ上で同定しました。得られたNSCの細胞表面表現型の CD184+CD44–CD271–CD24+CD15mid は、細胞内NSCマーカーを使って検証しました。この表現型を使って、ほぼ純粋なNSCの細胞集団をソートし、後にin vivoおよびin vitro両方での分化能を確認しました。

IパネルBにおいて、精製したNSCをニューロンおよびグリア細胞に分化させ、ニューロンを分取するための表面マーカーを同定するために、同じパネルを使ってイメージングによりスクリーニングしました。ニューロンの形態学的な特徴を捉えることができ、特異的マーカーを共染色できることから、イメージングスクリーンを用いた。ニューロン表面表現型候補である、CD44–CD184–CD24+CD15low はフローサイトメトリーで検証し、ニューロンの作製に使用しました。ニューロン細胞の他、BD Lyoplate™ ヒト細胞表面マーカースクリーニングパネルは、多能性幹細胞由来の心筋細胞の細胞表面マーカーを同定するためにも使用されています。²近年では、この方法がアルツハイマー病のヒト幹細胞モデルの開発に使用されました³。

References

Yuan SH, Martin J, Elia J, et al. Cell surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PLoS One. 2011;6(3):e17540. doi: 10.1371/journal.pone.0017540
Uosaki H, Fukushima H, Takeuchi A, et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 2011;6(8):e23657. doi: 10.1371/journal.pone.0023657
Israel MA, Yuan SH, Bardy C, et al. Probing sporadic and familial Alzheimer’s disease using induced pluripotent stem cells. Nature. 2012;482(7384):216-220. doi: 10.1038/nature10821