Single-Cell Multiomics

健常・疾患サンプルにおけるマルチオミックス解析

上記のワークフローから得られたデータを解析するために、mRNA発現、表面タンパク質発現、または両方の組み合わせを使用して、4つのCLLサンプルと3つの健常ドナーサンプルに対してt-SNEで解析しました。上記のワークフローから得られたデータを解析するために、mRNA発現、表面タンパク質発現、または両方の組み合わせを使用して、4つのCLLサンプルと3つの健常ドナーサンプルに対してt-SNEで解析しました。  AbSeqデータに基づいたt-SNEプロットでは、RNA-Seqデータのみを使用した場合と比較して、異なるサンプル間でより明確なクラスターが形成されました。さらには、mRNAとAbSeqの両方のデータを組み合わせることで、様々なサンプルの解像度が大幅に向上しました。t-SNEプロットで、 4つのCLLサンプルは個別にクラスターを形成しているのに対し、健常サンプルでは、クラスターの重複がみられ、CLL患者の臨床経過が不均一である可能性があることを示唆しています。これらの結果は、シングルセルプロファイルの分析におけるマルチオミクス・アプローチが重要であることを示しています.

健常サンプルとCLLサンプル間で差次的に発現するマーカー解析

健常サンプルとCLLサンプルの明確なクラスタリングに関わるマーカーの深い洞察を得るために、シングルセルのmRNAとAbSeqデータを使用して差次的発現解析を行いました。この解析により、健常サンプル（グループ1）と比較してCLLサンプルで減少したマーカーが特定されました。 すべてのCLLサンプルで差次的に増加した遺伝子またはタンパク質はグループ2（すべてのCLL）に、一部のCLLサンプルで増加したものをグループ3に示されています。 CLL患者で異常に発現したマーカーであるCD5は、他のサンプルと比較してCLL03およびCLL04で高いことが示されています。また、CD11cなど、CLL04（グループ4）に特に関連するマーカーのサブセットも発見されました。 興味深いことに、すべての細胞が同じレベルでCD11cを産生するわけではなく、これはCLLの腫瘍内不均一性を示唆しています。

T細胞解析

個別のクラスターはサンプルごとに分離され、タンパク質のみ、mRNAのみ、また両方の組み合わせに基づくクラスタリングの解像度はすべて同等です。

一過性に刺激された細胞クラスター（１４日目）は、新鮮なT細胞と慢性的に刺激された細胞とくらべ明確なクラスター形成が観察され、それぞれに特徴があることが示唆されました。これは、一過性に刺激された細胞が新鮮細胞と同様の表現型また機能性を示すという以前の報告とは対照的な結果となりました。慢性的に刺激された細胞（3, 7, 14日目）は新鮮な細胞とは異なるクラスターを形成しました。これは、それぞれにおいて固有の特性があることを示しています。

一致したBD^®AbSeqマーカーデータとフローサイトメトリーデータ

CD8 T細胞発現マーカーの割合と、フローサイトメトリーとAbSeqアッセイの両方で検出された細胞表面マーカーのそれぞれのタイムポイントによって示されるタンパク質発現動態は一貫していることが示されました。これらのデータは、AbSeqアッセイとフローサイトメトリーデータの一致とタンパク質発現を研究するための有用性を強く示しています。

Monocle解析によるTreg分化解析

教師なし高次元データ解析を使用して、Tregサブセットの識別能を上げました。Monocleアルゴリズムで、シングルセル細胞の軌道分析を行い、分化プロセルの遷移状態を定義するために使用しました。22のタンパク質と399のmRNAターゲットの発現に基づいて、８つの異なる状態が特定され、Tregの異なる分化状態が示唆されました。下の図（B）のシングルセルヒートマップは、8つの状態で差次的に発現する選択されたタンパク質と遺伝子を示しています。各状態に属する細胞は、CD45RAの進行性の喪失とHLA-DRの高発現に基づいて、左から右に配置され、ナイーブ細胞から活性化細胞への進行を表しています。CD45RA発現のレベルの違いに加えて、CD31はRTEの特性と一致して、状態7の細胞でのみ発現するため、これら3つの状態をさらに区別することができます。一方、状態5でのCD95の排他的発現とCD45RAの同時低発現は、ナイーブ細胞からアポトーシス感受性の活性化細胞への移行を示唆している可能性があります。

マルチオミックス解析によって明らかにされた異なるILCサブグループ

データ解析では、CD117- CD294- ILC1、CD117 +/- CD294 + ILC2およびCD117 + CD294-ILC前駆体/ ILC3（ILCP / ILC3）として従来定義されている循環ILCの3つの主要なグループを手動でゲーティングしました。シングルセルAbSeqおよびmRNAデータを使用して、3つのILCグループ間で差次的発現解析を行い、各グループに固有のタンパク質及びmRNA発現の特徴を特定しました。この解析により、ILCグループを定義する主要な転写因子の発現パターンが明らかになりました。例えば、T-betをコードする遺伝子（TBX21）は、ILC1細胞のサブセットでのみ発現していましたが、GATA3はILC2細胞で最高レベルで発現していました。最近の報告のように、RORγδをコードするRORCは、ILC3表現型を示す循環ILC前駆細胞（CD117 + CD294-ILCP / ILC 3細胞）によって部分的に発現されました。

偏りのない細胞クラスタリングは、異なるサンプル間で複数の細胞表面型を識別します

t-SNEでは、データ視覚化のため、実験から得られたマルチオミックデータと、細胞集団の検出のためのバイアスのないクラスタリング・アルゴリズムPhenoGraph (SeqGeq™ソフトウェアプラグイン)を使用しました。PhenoGraphは、4つの異なる組織タイプにわたって12個の細胞クラスターを識別しました。 12のクラスターのうち、4つは、コントロール・クラスター1、5、7、および12と比較して、HFDマウスの脂肪組織における細胞密度と分布の違いを示しました。            

HFD脂肪組織からのCD8 + T細胞のMonocle解析は、これらの細胞の疲弊化を示唆しています

Monocleを使用した脂肪組織のCD8 + T細胞の特異的分析により、5つの分化状態が識別されました。コントロールマウスのCD8 + T細胞は状態1と2に属していましたが、HFDマウスの細胞はさらに状態3、4、5に向かう軌跡をたどりました。HFDマウスの状態2、3、4、5はCD279（PD-1）タンパク質やmRNA（Pdcd1）などのマーカーとTigitなどの疲弊マーカーの発現が上昇しました。