白血病 | 【臨床】フローサイトメトリー検査

白血病では、無制御な増殖を来した未成熟細胞や異常細胞が白血球を過剰産生します。多くの場合、十分な赤血球および血小板を産生することができなくなります。急性白血病の場合には、細胞が増殖を続けながらも最終分化には移行しない段階で正常な分化経路が遮断されています。2018年GLOBOCAN調査によれば、白血病症例は全世界で増加傾向にあります。437,033例の白血病新規症例が登録され、全世界の発生率は5.2、死亡率は3.5（10万人当たりのAge‐standardized rates(ASRs)）となりました¹。骨髄中の前駆細胞に基づいて、リンパ性白血病か骨髄性白血病に分類されます。リンパ性（リンパ芽球性）白血病はTまたはBリンパ性前駆細胞に起因し、非リンパ性白血病、つまり骨髄性白血病は赤血球・顆粒球・単球・血小板の前駆細胞に起因します¹。

白血病の原因

白血病は骨髄中のリンパ球や骨髄系前駆細胞の遺伝子変異または代謝変化が原因で起こります。白血病の環境・生活習慣関連危険因子には、喫煙、屋内・屋外空気汚染、放射線や特定の化学物質への曝露、放射線療法、化学療法、一部の遺伝性疾患（ダウン症候群など）などがあります²。

白血病の種類

白血病は白血病細胞の増殖速度に基づいて急性か慢性に分類されます。白血病は主に4種類あり、骨髄球系の慢性・急性骨髄性白血病（CMLおよびAML）、リンパ球系の慢性・急性リンパ性白血病（CLLおよびALL）です⁴。米国でのがんおよび白血病の症例は増加しています。20年間で（1998年から2018年にかけて）全種類の白血病が大幅に（CLLは187%、AMLは108%、CMLは96%、ALLは92%）増加しました^1,4。

白血病の診断方法

白血病は複雑な多因子疾患であり、診断には症状の確認、身体診察、血液検査、骨髄生検、脳脊髄液（CSF）評価、放射線学的検査、遺伝子検査などの学際的なアプローチが必要となります。フローサイトメトリーは、白血病の診断に不可欠な重要な手段であることがわかっています。

白血病の種類も、ZAP-70やCD38などの特異的なマーカーを用いるフローサイトメトリーで末梢の白血病細胞の表現型を解析することにより、特定することができます⁵。脳脊髄液（CSF）のフローサイトメトリー解析で単核球や浸潤性異型細胞の高値が明らかになった場合は、白血病の骨髄外や中枢神経系（CNS）への浸潤を示しています^5,6。

フローサイトメトリーを用いる白血病の解析

フローサイトメトリーは、白血病の診断とモニタリングの両方において極めて有効な手段であることが報告されています⁵。

芽球細胞の検出

フローサイトメトリーは、骨髄性芽球とリンパ性芽球の識別に一般的に使用される手法です⁵。

芽球や未熟細胞の特定：一般的に、未熟細胞や芽球は、SSCドットプロットでのCD34発現陽性とCD45の低強度レベル（CD45low）で特定されます。
異常芽球：未熟細胞に異常抗原が発現している場合は、白血病の可能性が高い例として、さらなる検査の適応となります。異常としては、成熟阻害、別系統の抗原（骨髄性細胞におけるリンパ性細胞マーカーCD19、CD7など）の発現⁷、抗原の非同期的な発現（CD34陽性芽球における成熟好中球マーカーCD15の発現など）⁷、抗原発現の強度異常（T-ALLのCD3の発現が少ないこと、B-ALLのCD20の発現が少ないことや発現がないことなど）⁵が挙げられます。

白血病の確定診断：急性白血病の場合

恒常性が維持されている場合、骨髄中芽球や末梢血中芽球は、全細胞の5%未満です。芽球が高値の場合は懸念される状態であり、さらなる検査を行うことが妥当です。AMLでは、芽球の数と表現型に異常が認められる場合があります。

慢性リンパ性白血病の診断

CLLの診断は形態学的解析と免疫表現型解析によって行います。WHOの診断基準によると、典型的なCLLの免疫表現型解析では、腫瘍B細胞におけるCD20の弱発現とCD5、CD19、CD23の共発現が認められます（さらに、3カ月にわたって末梢血中の循環新生細胞数が5,000/mL以上）⁸。CD5、CD19、CD23、CD20（弱発現）、免疫グロブリンκ/λ鎖などの一部のマーカーは、ルーチン診断で使用することでコンセンサスが得られており、パネルのスクリーニングに必要であるとみなされています。その他のマーカーも、腫瘍B細胞の特性をさらに解明するための追加情報が得られたり、予後に関して有用であったりするため、推奨されます（弱発現のCD79b、CD81またはCD38、CD45など）⁸。

慢性白血病の残存病変のモニタリング

フローサイトメトリーは、慢性白血病の残存病変を高感度で検出できる手法であると報告されています。シーケンシャルゲーティングを使用して、CD5+、CD19+などの複数のCLLマーカーを同時にモニタリングすることができます。正常細胞と腫瘍細胞のマーカー発現も識別することができます⁸。

骨髄性芽球とリンパ性芽球の識別：

WHOとEuropean Group for the Immunological Characterization of Leukemias（EGIL）の両方の分類基準で、フローサイトメトリーによる白血病の種類の特定に使用できる特異的な系統マーカーが示されています⁸。骨髄性芽球では細胞質内ミエロペルオキシダーゼ（cyMPO）とCD117が陽性となり、リンパ性芽球は細胞質内CD79a（cyCD79a）または細胞質内CD3の陽性で確認することができます⁷。

白血病のサブグループ化

白血病のサブグループ化に使用するフローサイトメトリーパネルは、調べる細胞系統に応じて異なります⁷。

B細胞系統の異常：B細胞系統を調べる場合は、CD5、CD10、CD19、CD20、CD45、免疫グロブリンκ鎖とλ鎖が含まれる抗体パネルが使用されるのが一般的です^8,9。
T細胞系統とNK細胞の異常：T細胞とNK細胞はリンパ球増殖性疾患の15%を占めています。T細胞とNK細胞に発現する抗原には重複するものがあります。T/NK細胞腫瘍を調べる場合は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8の各マーカーが含まれる抗体パネルを使用することができます⁹。
末梢血球数の増加：末梢血球数が増加した場合は、CD19のフローサイトメトリースクリーニングが推奨されます。
骨髄単球系統の評価：骨髄単球マーカーの例としてCD13、CD33、CD16、CD10、CD11b、CD14が挙げられ、骨髄単球系統の評価にはCD64が含まれます¹⁰。
抗体の異常：抗体レベルの異常が認められた場合は、CD19マーカーとCD56マーカーが含まれる形質細胞系統のスクリーニングパネルが使用されます¹¹。異常としては、成熟阻害、別系統の抗原（骨髄性細胞におけるリンパ性細胞マーカーCD19、CD7など）の発現、抗原の非同期的な発現（CD34陽性芽球における成熟好中球マーカーCD15の発現など）、正常な抗原発現の異常な強度（T-ALLのCD3の発現が少ないこと、B-ALLのCD20の発現が少ないことや発現がないことなど）が挙げられます。CLLでは異常なCD5発現が認められ、濾胞性リンパ腫では異常なCD10の発現が認められる場合があります¹²。
フローサイトメトリーは、白血病のモニタリングと微小残存病変の評価にも極めて有用です⁸。

フローサイトメトリーを用いる微小残存病変（MRD）の評価

微小残存病変（MRD）は、治療中や治療後も少数の白血病細胞が患者の体内に残っている状態です。これらの細胞は将来の再発の原因となる可能性があり、MRDのモニタリングは、治療強度の増量や減量などの治療の調節、移植の適格判定、治療結果の通知において重要です。急性リンパ性白血病と急性骨髄性白血病の患者におけるMRDの評価について、マルチカラーフローサイトメトリーの予後に関する有用性が報告されています¹³。MRD陰性は、多発性骨髄腫でも、長期にわたる予後が良好であるという優れた予測因子とみなされます¹⁴。

フローサイトメトリーによって、白血病細胞の表現型の特性評価が容易になり、MRDのモニタリングも可能となります。蛍光標識モノクローナル抗体のセットをマルチカラーフローサイトメトリーで使用して、MRDを特定するマーカーのパネルを解析することができます^5,11。フローサイトメトリーはAML患者のMRDをモニタリングするためのツールとして使用されます。標準化された定量フローサイトメトリープロトコルを、3～8色のパネルによるMRD評価時に使用することができます^{13, 14}。MRD値が0.01%（骨髄穿刺液中骨髄細胞数が1 MRD細胞/10,000骨髄細胞）を上回る場合は、高い再発リスクと低い生存率に関連しています¹⁵。フローサイトメトリーでは、形態学的に多義性を持つ細胞の表現型と機能を同時に明らかにすることができます。

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