Calciumアッセイ

細胞質ゾルの遊離Ca2 +濃度（[Ca2 +] i）の一時的な増加は、細胞シグナル伝達に関与する多くのリガンド膜貫通受容体システムの細胞活性化の指標を提供することができます。このため、リガンドによって引き起こされる、または活性化リガンドまたはその受容体に対する抗体によって防止される一過性の[Ca2 +] InFluxのレベルを測定するアッセイを使用して、これらの生物学的に活性な分子のレベルおよび比活性を決定することができます。

カルシウムイオンは細胞内シグナル伝達において独特の役割を果たしており、細胞シグナル伝達経路の重要なセカンドメッセンジャーであると考えられています。ケモカイン、アナフィラトキシン、およびその他の炎症性メディエーターは、それらの細胞受容体に結合するとカルシウム動員反応を引き起こす可能性があります。これらの場合、受容体-リガンド相互作用は、膜の内側にあるグアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化します。その結果、ヘテロ三量体Gタンパク質は、ホスホリパーゼCを活性化して、ホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸を切断し、ジアシルグリセロールとイノシトール三リン酸を放出します。イノシトール三リン酸は細胞内貯蔵からのCa2 +の放出を引き起こしますが、ジアシルグリセロールと細胞質ゾルのCa2 +レベルの増加は、細胞内のプロテインキナーゼCの活性化に関係しています。リン酸化イベントの増加は、これらの活性化された細胞による酸化剤の生成と分泌機能に関連しています。

Indo-1やFura-2など、Ca2 +と複合体を形成すると蛍光特性が変化する、さまざまな蛍光指示薬が利用可能です。たとえば、励起光の波長を約358 nmに設定した分光蛍光光度計を使用すると、Indo-1の最大蛍光発光はCa2 +を含まない培地での約485nmから色素がCa2 +で飽和した場合の約405nmにシフトします。Ca2 +結合色素とCa2 +フリー色素の蛍光比を使用して[Ca2 +] iを決定できます。これらの色素の細胞透過性アセトキシメチル（AM）エステルは、細胞内に受動的にロードすることができ、細胞内エステラーゼによって細胞不透過性生成物に切断されます。カルシウム動員アッセイを実行するために、標的細胞にIndo-1をロードし、分光蛍光光度計内の温度制御された（37 C）攪拌キュベットに入れ、358nmの波長の光で励起します。405および485nmでのベースライン発光を決定した後、刺激物（ケモカイン、アナフィラトキシン、またはその他の炎症性メディエーター）を細胞懸濁液に迅速に注入します。放出された蛍光信号は継続的に監視され、次の120〜300秒間記録されます。

放出の比率（E405 / E485）に反映されるように、細胞質ゾルの遊離Ca2 +のレベルは、リガンドが刺激性である場合、急速に増加します。（すなわち、その受容体に細胞内のシグナルを伝達させ、細胞内貯蔵から細胞質ゾルへのCa2 +の動員をもたらす）。この応答に続いて、[Ca2 +] iがベースラインレベルに戻ります。 細胞質ゾルの遊離Ca2 +の一時的な増加の振幅は、ED50の決定を可能にする標的細胞を活性化するために使用される刺激性リガンド濃度に依存します。

その他の方法

上記の方法に加えて、特定のケモカインの生物学的活性を決定するためにいくつかの方法が使用されてきました。これらには、CCおよびCXCケモカインの両方に対するCD11b / CD18アップレギュレーションアッセイが含まれます。 好中球エラスターゼまたはβ-グルクロニダーゼ放出アッセイおよびCXCケモカインの好中球酸化バーストアッセイ、MIP-1αおよびMIP-1βの造血コロニー形成アッセイ、CCケモカインのヒスタミン放出アッセイなどです。