細胞外小胞（EV）は、バイオマーカーおよび治療標的として多大な可能性を秘めた膜小胞です。様々な細胞が分泌するこれらナノサイズの小胞は多様な成分を運ぶため細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たします。しかしEVは小さく多種多様であるためその解析には難しさもあるのが現状です。
EV解析の標準手法として強く期待されるフローサイトメトリーですが1、2、3、4、EV解析には細胞とは異なる難しさがあります。例えばフローサイトメーターの通常測定範囲である10～100 μmをEV（30～1,000 nm1）が下回ることや、EVの組成の多様性や濃度の問題などがその要因です。しかし、フローサイトメトリー機器の進歩や測定法の標準化によってこの問題は現在克服されつつあります。
BD バイオサイエンスは革新的で新しい機器やリソースを提供しており、これまでは手の届かなかったEV研究における課題解決に貢献します。
Using the latest advances in flow cytometry to tackle challenges in extracellular vesicle characterization というタイトルのブログをお読みください。
BD バイオサイエンスがNatureと協力して企画したウェビナーをご覧ください。フローサイトメトリーやソーターを使用したEV解析・ソーティングの最新情報について、Penn Cytomics and Cell Sorting Resource LaboratoryのJonni Moore博士、オレゴン健康科学大学のTerry K. Morgan博士、アムステルダム大学医療センターのEdwin van der Pol博士にご講演いただきます。
本webinarでは、Edwin van der Pol博士よりフローサイトメトリーを用いて100 nm未満のEVの濃度をスケーラブルかつ再現性よく測定する方法について、Moore博士より低侵襲性のリキッドバイオプシーサンプルを用いたEV解析とその臨床応用性について、Morgan博士より母体血中EVと妊娠時の諸症状に関する解析等についてお話しいただきます。
このビデオでは、検査や治療法や診断法の改善・開発において、どのようにBD製品が使用されているかご紹介いたします。
Heterogenicな特徴のあるEVの研究において、一粒子単位の解析が最近注目を集めています。本資料では、シングルEV解析の重要性、膜染色や抗体染色、さらにはEV濃度測定やサイズ測定のプロトコル等について、東京医科大学の吉岡先生に詳しくご解説いただきました。ぜひこの機会に、フローサイトEV解析の最新詳細情報をご入手ください。
EV対応型BD FACSymphony™ A1 フローサイトメーターを使用したシングルEV解析
～EV研究におけるシングルEV解析の重要性～
吉岡 祐亮 先生（東京医科大学医学総合研究所 分子細胞治療研究部門）
References
- Gul B, Syed F, Khan S, Iqbal A, Ahmad I. Characterization of extracellular vesicles by flow cytometry: Challenges and promises. Micron. 2022;161:103341. doi: 10.1016/j.micron.2022.103341
- Irmer B, Efing J, Reitnauer LE, et al. Extracellular vesicle-associated tyrosine kinase-like orphan receptors ROR1 and ROR2 promote breast cancer progression. Cell Commun Signal. 2023 ;21(1):171. doi: 10.1186/s12964-023-01186-1
- Mandelbaum N, Zhang L, Carasso S, et al. Extracellular vesicles of the Gram-positive gut symbiont Bifidobacterium longum induce immune-modulatory, anti-inflammatory effects. NPJ Biofilms Microbiomes. 2023;9(1):30. doi: 10.1038/s41522-023-00400-9
- Cohen SJ, Meyerovich G, Blank S, et al. Microbiota transfer following liver surgery involves microbial extracellular vesicle migration that affects liver immunity. Hepatol Commun. 2023;7(6):e0164. doi: 10.1097/HC9.0000000000000164.
BD FACSymphony™ A1 フローサイトメーター、BD FACSDiva™ ソフトウェア、FlowJo™ ソフトウェア、および Rosetta Calibration Pluginを使用したEV解析の5ステップのワークフロー
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微粒子検出器（SPD）の調整
Step 1: 微粒子用標準化ビーズを使用しSPD感度を調節します。
- 標準ナノサイズビーズを用意します。
- 必要に応じて、Picomotor Applicationを使用しSPD の位置を調整します。
- ビーズのシグナルを参照しSP SSCのvoltageを調整します。
再現性のある低バックグラウンドノイズレベルの確認
Step 2: バックグラウンドノイズを低減するための起動手順を実行します。
- BD® Detergent Solution Concentrateで流路を洗浄します。
- サンプル希釈液を測定し、バックグラウンドノイズを確認します。
EVサンプルの測定とThreshold設定の組み合わせ”OR”設定の効果
Step 3: Step 3: 実験コントロール、キャリブレーション、およびThresholdを適切に設定します。
- 実験コントロールとSP SSCおよび蛍光キャリブレーションのガイドとして、MiFlowCyt-EVをご参照ください。
- 蛍光とSP SSC双方のシグナルが弱いイベントのみをカットするThresholdの”OR”設定を利用してイベントを逃さず最大限に取得できます。
- 個々のシグナルを正しく分離できているか、サンプルを段階希釈して確認します。
| 3.1 Buffy only* | 3.5 Single-stained controls* |
| 3.2 Buffer with reagents* | 3.6 Procedural controls* |
| 3.3 Unstained controls* | 3.7 Serial dilution* |
| 3.4 Isotype controls | 3.8 Detergent-treated EV samples |
Welsh JA, et al. Journal of Extracellular Vesicles. 20209;(1):1713526.
Rosetta CalibrationビーズとEVサンプルの測定
Step 4: EV直径サイズの測定（オプション）
- SP SSC検出器の設定を変えずにRosetta CalibrationビーズとEVサンプルを測定します。
- 多くのサイズのビーズが測定範囲に入り且つ必ず最小サイズのビーズが測定できるよう、Thresholdやvoltageを設定します。
EVデータの解析
Step 5: BD FACSDiva™ ソフトウェアおよびFlowJo™ ソフトウェアを活用します。
• 互換性のあるソフトウェアを使用してデータを取得しBD FACSDiva™ ソフトウェアおよびFlowJo™ ソフトウェアを使用してEVデータを解析します。
BD FACSymphony™ A1 フローサイトメーターを使用したEVの検出
BD® Small Particle Detectorオプションによる90 nmのポリスチレンビーズの分解能
Detection of 90nm polystyrene beads
Separation of 90nm polystyrene beads from noise
Side scatter sensitivity of BD® Small Particle Detector
Characterization of extracellular vesicles from human MCF7 cell line*
* This work was performed in collaboration with Wauben Lab (Utrecht University, The Netherlands) and was supported by the TRAIN-EV Marie Skłodowska-Curie Action-Innovative Training Network, http://train-ev.eu grant agreement No 722148
BD バイオサイエンスは、EV研究を支援する柔軟なソリューションを提供します
Rosetta Calibrationプラグイン搭載のFlowJo™ ソフトウェア
Rosetta Calibrationプラグイン搭載のFlowJo™™ ソフトウェアとExometryのRosetta Calibration製品を併用すると、10 μm以下の小さな球状粒子のサイズを算出できます。
このプラグインを使用すると、Rosetta Calibrationビーズの測定データを利用して微粒子のサイズを校正できます。* Rosetta Calibrationプラグインは、FlowJo™ 10 ソフトウェアとRosetta Calibrationソフトウェアを連携するプラグインです。
*計算は、Rosetta Calibrationソフトウェアによって実行されます。このソフトウェアは別途インストールが必要です。Rosetta Calibrationマニュアルを確認し、https://www.exometry.com/products/rosetta-calibration (https://www.exometry.com/products/rosetta-calibration) からRosetta Calibrationソフトウェアをダウンロードしてください。
研究用です。本製品は、疾病の診断・治療または予防に使用することはできません。
BD flow cytometers are Class 1 Laser Products.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic or therapeutic procedures.